骨髓细胞在小鼠实验性肾小球肾炎中的作用

摘要

目的：本研究旨在观察骨髓细胞是否可以分化成为竹叶青蛇毒导致的系膜增生型肾小球肾炎小鼠中的肾小球细胞，同时观察中药川芎嗪和GM-CSF，促进骨髓细胞增殖因素，对骨髓细胞向肾小球细胞分化的影响。 方法：绿色荧光蛋白(GFP)标记的C57BL/6转基因小鼠提供骨髓，同种无荧光标记的普通C57BL/6小鼠随机分为6组：①正常对照组：小鼠不进行任何处理，提供正常小鼠的各种参考值及进行肾脏组织的各种对照。②骨髓移植组：受体鼠在<'60>Co全身均匀照射后六小时内接受供体的GFP标记的骨髓细胞，五周后观察受体鼠的血常规及进行其骨髓细胞的流式细胞仪检测，以明确受体鼠的骨髓重建是否成功。③骨髓移植+竹叶青蛇毒组：受体鼠在接受骨髓移植后的五周通过尾静脉注射竹叶青蛇毒诱发系膜增生型肾小球肾炎，竹叶青蛇毒注射后的第7、14、28、56天观察受体鼠肾脏中的绿色荧光。④骨髓移植+竹叶青蛇毒+GM-CSF组：骨髓移植后的受体鼠在竹叶青蛇毒注射后连续腹腔注射GM-CSF一周，在上述各时间点观察肾脏组织中的绿色荧光。⑤骨髓移植+竹叶青蛇毒+川芎嗪组：骨髓移植后的受体鼠在竹叶青蛇毒注射后连续腹腔注射川芎嗪一周，在上述各时间点观察肾脏组织中的绿色荧光。⑥骨髓移植+竹叶青蛇毒+GM-CSF+川芎嗪组：骨髓移植后的受体鼠在竹叶青蛇毒注射后连续腹腔注射GM-CSF及川芎嗪一周，在上述各时间点观察。肾脏组织中的绿色荧光。以上各组中小鼠分别在不同时间点取肾，制备冰冻切片和石蜡切片，并采用免疫荧光组织化学双标和免疫组织化学等方法在激光共聚焦显微镜和光镜下观察受体鼠肾脏中绿色荧光的的分布、数量和进一步鉴别其细胞类型。 结果： <'60>Co全身均匀照射后进行骨髓细胞移植的骨髓移植组小鼠的活动与饮食与正常小鼠无明显差别，只是毛发渐变灰白，五周后其血常规与正常鼠相较无明显差异，流式细胞仪检测显示其骨髓细胞中GFP阳性细胞的比例也达到59.62±13.21％，提示骨髓重建成功。在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察不同组受体鼠不同时间的肾脏组织的冰冻切片，发现：②、③组受体鼠肾小球内在不同时间点均未见到绿色荧光，但个别肾小管处有少量绿色荧光；④、⑤、⑥组受体鼠在不同时间点时其肾小球内均可见到少量绿色荧光，且似乎⑥组受体鼠肾小球内的绿色荧光较多。GFP免疫组织化学的结果与上述相同，个别肾小管上皮细胞和肾小球内少量细胞呈胞质棕褐，核大紫蓝色，似乎为外源性GFP阳性细胞。为了进一步鉴别受体鼠肾小球内GFP阳性细胞的种类，进行了免疫荧光组织化学双染色，结果显示：④、⑤、⑥组受体鼠肾小球内的GFP阳性细胞可能是肾小球毛细血管袢内的血细胞而非肾小球的固有细胞，即内皮细胞、上皮细胞或系膜细胞。 结论：尽管已经证明骨髓细胞在一定条件下可以向肾小管上皮细胞分化，并且在本实验中再一次验证了这一结果，但目前尚没有充分的证据证明在类似的条件下，骨髓细胞可以向肾小球固有细胞分化。实验中还发现，GM-CSF的干预可能对受体鼠并无益处，因为GM-CSF的应用可能恶化了小鼠的实验性系膜增生型肾小球肾炎，而使其进一步进展成为局灶性节段性肾小球硬化。

目录

论文说明：中英文词表

声明

前言

材料与试剂

一实验动物

二主要试剂

三其他试剂的配制

四仪器

第一部分小鼠系膜增生型肾小球肾炎模型的复制

一材料与方法

(一)实验动物

(二)动物模型的复制

(三)标本处理及观察

(四)统计学分析

二结果

(一)一般情况

(二)肾功能变化

(三)肾脏的病理变化

三讨论

第二部分骨髓移植模型的建立

一材料与方法

(一)实验动物

(二)骨髓移植模型的建立

(三)标本处理及观察

(四)统计学分析

二结果

(一)一般情况

(二)血常规

(三)流式细胞仪结果

三讨论

第三部分骨髓细胞在小鼠实验性肾小球肾炎中的作用

一材料与方法

(一)实验动物分组

(二)实验方法

(三)标本处理及观察

二实验结果

(一)激光共聚焦显微镜

(二)免疫组织化学

(三)免疫荧光组织化学

三讨论

全文总结

参考文献

骨髓干细胞移植在肾脏疾病中的研究进展

致谢