中华按蚊和雷氏按蚊的微卫星DNA库构建及多态位点的筛选

摘要

中华按蚊 (Anopheles sinensis)和雷氏按蚊(An．lesteri)(原嗜人按蚊 An．anthropophagus)是我国分布广且常见的蚊种，是其分布区疟疾的重要传播媒介，实施有效的蚊媒防制手段是疟疾控制的重要环节，而蚊媒的生物学特性是制定防制策略的基础。本研究拟构建中华按蚊和嗜人按蚊的微卫星DNA库，并筛选其中多态的微卫星位点，其微卫星DNA序列库可为按蚊基因组学研究积累基础资料；多态的微卫星DNA位点将为中华按蚊和雷氏按蚊的基因定位、群体遗传结构和生态学等领域的研究提供新的分子标志。 本研究应用基因组DNA的酶切片段与生物素标记的(AAT)<,17>，(GA)<,25>，(CCT)<,17>，(AC)<,25>，(CAG)<,17>，(CA)<,18>，(CAC)<,5>，(TC)<,10>，(GT)<,8>和(TG)<,18>等寡核苷酸探针杂交，结合亲合素富集和超滤离心浓缩，首先将基因组DNA中含微卫星DNA的片段富集，经3次PCR扩增放大后，插入T载体，转化大肠杆菌(E. coli)，筛选含微卫星DNA序列的阳性克隆，测定分析其序列，完成中华按蚊和雷氏按蚊微卫星。DNA库的构建。在构建中华按蚊微卫星DNA库的基础上，挑选合适的微卫星位点，设计、合成引物，建立各微卫星位点的PCR扩增体系。应用经分子鉴别的中华按蚊现场样本，聚丙烯酰氨凝胶电泳和基因扫描筛选具有多态性的微卫星位点。 本研究获得的结果如下： 1．构建的中华按蚊微卫星DNA序列库中包含282条序列，其中18条序列完全相同，21条序列较短(小于100 bp)，故有效的微卫星DNA序列共252条，GenBank注册登记号为EF620047－EF620298。 2．本研究的中华按蚊微卫星DNA序列库中双核苷酸重复最为常见，三核苷酸重复次之，多核苷酸重复少见，其中以(CA)<,n>和(GT)<,n>的微卫星DNA序列含量最为丰富，重复次数最多的可达54次。其中完整的微卫星DNA序列89个，占35.3％；非完整的序列82个，占32.5％；其余为复合序列，占32.2％。 3．笔者在构建的中华按蚊微卫星DNA库中，选取了22条适当的序列，设计、合成引物，建立了PCR扩增体系，结果显示其中15对引物有特异扩增条带。 4．经过对现场样本的分子鉴别，选用确认的中华按蚊4个群体的40个样本，PCR扩增各微卫星位点，检测结果显示有10个微卫星位点存在多态性，即：ANS1，ANS2，ANS3，ANS5，ANS8，ANS11，ANS13，ANS14，ANS15和ANS25。 5．本研究分离获得61条雷氏按蚊的微卫星DNA序列，其中有效的序列共58条，GenBank注册登记号为：EF620299－EF620356。

目录

声明

前言

第一部分：中华按蚊微卫星DNA库构建

1.材料

2.方法

3.结果与讨论

第二部分：中华按蚊多态微卫星DNA位点的筛选

1.材料

2.方法

3.结果与讨论

第三部分：雷氏按蚊微卫星DNA的分离和筛选

1.材料和方法

2.结果与讨论

小结

参考文献

致谢

综述 应用微卫星DNA标记研究蚊虫群体遗传的现状