中药川芎挥发性成分分析及药代动力学研究

摘要

药物代谢研究在药物研究与开发中占有举足轻重的地位,中药活性成分代谢的研究近年来越来越多地引起人们的关注。本论文以传统中药川芎为对象,提取其中的挥发油,并分析其化学成分,比较几种提取方法所得挥发油化学组成成分上的差异；从挥发油中分离纯化制备得到主要有效成分藁本内酯单体的对照品；建立了HPLC法测定挥发油以及生物样品中藁本内酯的含量；并应用此方法研究了口服给以川芎挥发油后,藁本内酯在小鼠和大鼠体内的药动学动态变化过程以及生物转化情况；研究了藁本内酯在小鼠体内各组织间的分布特性；同时还建立了LC-ESI-MS法测定肝微粒体孵育液中的藁本内酯,并应用该方法开展了藁本内酯在肝微粒体中的体外代谢研究；研究结果显示藁本内酯在体内和体外存在生物转化,且有一定的差异。 本论文通过上述研究,丰富了中药药物代谢和药动学的研究内容,为临床合理用药提供了理论的参考,为中药现代化研究进行了有利的探索。 药物代谢动力学研究在药物的研究开发和合理应用中具有极其重要的意义,对中药活性成分的代谢动力学研究,近几年来也引起了人们的广泛重视。中药代谢动力学研究的内容非常丰富,生物样本成分复杂,测定的目标有效成分浓度非常低,干扰物质多,既存在内源性物质的干扰,又有主要代谢产物的干扰,还有中药中其他成分的干扰。然而,随着分子生物学技术以及现代仪器分析技术的迅速发展,新的检测技术不断的出现,给中药药代动力学研究提供了高灵敏度、高精密的、高准确度的分析检测手段,推动了中药药代动力学的发展。中药活性成分的代谢研究对中药作用机理探讨、中药新剂型研发、中药质量评价和中药的临床应用等等,均具有指导意义和推动作用,已经成为中药现代化研究的重要切入点。 本论文分为5个部分,研究了中药川芎挥发油的提取、主要有效成分的分离、有效成分的药动学研究、组织间分布研究以及其体外代谢的影响因素研究和酶促反应动力学研究。 第一部分 川芎挥发油的提取、物理参数测定及化学成分分析 目的：从川芎药材中提取挥发油,并测定其物理参数,分析其中的化学成分。 方法：用经典的水蒸汽蒸馏法从粉碎的川芎药材中提取挥发油；采用比重瓶法测定其密度；应用阿贝氏折光仪测定折光率；并用气相色谱-质谱联用仪研究其中的化学成分。 结果：水蒸汽蒸馏法提取川芎挥发油的产率为0.4％,测定川芎挥发油密度为0.9083g/mL,折光率为1.5331。GC-MS法测定得该挥发油中含有29种成分,其中以藁本内酯含量最多,其次是正丁烯基苯酞、丁基苯酞、α-萜品醇。 第二部分 藁本内酯单体的分离纯化及结构鉴别 目的：从川芎挥发油中分离纯化藁本内酯单体,鉴定其结构,并考察其稳定性,以选择合适的储存条件。 方法：用玻璃柱层析法分离挥发油中的藁本内酯单体,以硅胶为固定相,用石油醚(30～60℃)：乙酸乙酯(100:1)洗脱。运用薄层色谱法结合高效液相色谱法监测流分,合并含单一成分的组分,并挥干溶剂后,得到的化合物进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振光谱和质谱分析,鉴定其结构。用气相色谱-质谱联用仪测定该藁本内酯的含量,并对其进行不同储存条件下的稳定性考察。 结果：用硅胶柱层析法制备得到藁本内酯单体,经过四大光谱的结构鉴别,确定为Z-藁本内酯,纯度为98.65％。并由4种储存条件下藁本内酯稳定性考察结果显示,温度是影响藁本内酯稳定性的主要因素,将藁本内酯置于-20℃冷冻保存即能保持其基本稳定,18个月的降解率为1.26％。 第三部分 口服川芎挥发油后藁本内酯的代谢动力学研究 目的：建立生物样品中藁本内酯含量测定的高效液相色谱法,并将其应用于藁本内酯在小鼠和大鼠体内的药动学研究。 方法：生物样品用正己烷直接萃取浓缩后,注入高效液相色谱仪,以尼莫地平为内标,选择Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,预柱为Pelliguard TM LC-18,以乙腈-10％异丙醇水溶液(58:42)为流动相,流速为1.0 mL/min,在室温下,于324 nm处进行分析测定,用内标法计算含量。数据用DAS软件的双峰模块进行分析处理,并拟合药动学参数。 结果：由药时曲线可见,藁本内酯进入体内后吸收迅速,达峰时间短,且药时曲线出现双峰现象。DAS软件拟合的结果显示,藁本内酯在大鼠体内的t1/2为182 min,小鼠体内为106 min。由此说明藁本内酯在体内的消除较快,滞留时间较短。 第四部分 口服川芎挥发油后藁本内酯的组织分布特性研究 目的：建立适用于测定小鼠各组织中藁本内酯的含量的HPLC法,并研究口服川芎挥发油后藁本内酯在小鼠体内各组织间的分布特性。 方法：生物样品用正己烷直接萃取浓缩后,注入高效液相色谱仪,以尼莫地平为内标,选择Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,预柱为PelliguardTM LC-18,以乙腈-10％异丙醇水溶液为流动相,流速为1.0 mL/min,在室温下,于324 nm处进行分析测定,用内标法计算含量。分别考察小鼠给以川芎挥发油后10 min、1 h、10 h时血浆及各组织中的藁本内酯含量情况。 结果：藁本内酯与内标物尼莫地平保留时间分别为7.2 min和5.9 min,藁本内酯在各组织中一定浓度范围内线性关系良好,各组织中低、中、高浓度的回收率及精密度均符合方法学要求。藁本内酯在小鼠体内各主要效应器官之间分布特性是C肺>C心>C脑,在主要消除器官为C肝>C脾>C肾。在血浆和肝脏中藁本内酯存在生物转化。 第五部分 藁本内酯在肝微粒体中体外代谢的初步研究 目的：建立测定肝微粒体孵育液中藁本内酯含量的高效液相色谱-质谱联用法,进行藁本内酯体外代谢影响因素的研究,并考察藁本内酯的酶促反应动力学。 方法：于肝微粒体温孵液中加入等体积的冰冷的甲醇,以终止反应同时沉淀其中的蛋白。取高速离心后的上清液适量,注入高效液相色谱-质谱联用仪,以尼群地平为内标,测定其中藁本内酯的含量。考察温孵时间、酶蛋白浓度、底物浓度对藁本内酯体外代谢的影响,并确定最佳温孵条件,进行酶促反应动力学研究,测定酶促反应动力学参数。通过六种同工酶的特异性抑制实验,确定参与藁本内酯代谢的主要同工酶。 结果：酶促反应动力学参数测定的最佳温孵条件为：0.5 g/L的酶蛋白浓度,温孵时间为30 min。测定最大反应速度Vmax为1.50 μmol/(L·min·g)蛋白,米氏常数Km为166.62 omol/L,内在代谢清除率CLint为8.99 mL/(min·g)蛋白·CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2是参与藁本内酯代谢的主要代谢酶。藁本内酯在体外肝微粒体中存在生物转化。

目录

声明

摘要

前言

第一部分川芎挥发油的提取、物理参数测定及化学成分分析

一、引言

二、实验部分

1.仪器和试药

2.实验方法与结果

3.讨论

参考文献

第二部分藁本内酯单体的分离纯化及结构鉴别

一、引言

二、实验部分

1.仪器和试药

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第三部分口服川芎挥发油后藁本内酯的代谢动力学研究

一、引言

二、实验部分

1.仪器和试药

2.实验方法

3.实验结果

4讨论

参考文献

第四部分口服川芎挥发油后藁本内酯的组织分布特性研究

一、引言

二、实验部分

1.仪器和试药

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第五部分藁本内酯在肝微粒体中体外代谢的初步研究

一、引言

二、实验部分

1.仪器和试药

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

综述：中药药动学研究概况

致谢

附录：硕士期间发表的论文