重症急性胰腺炎早期大鼠肠道黏膜屏障功能的改变及其与Occludin蛋白的相关性研究

摘要

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种发病急、病情进展快、并发症多,并伴有极高死亡率的严重疾病,是临床常见急腹症之一。其发病机制复杂,目前对其研究尚不清楚,治疗缺乏有效的方法。 SAP后期发生的坏死胰腺组织感染及其并发的多器官功能衰竭是SAP最重要的并发症,是目前引起SAP高死亡率的一个重要原因。已有的研究表明,引起SAP后期胰腺感染的关键诱因是肠道黏膜屏障功能损伤所致的肠道菌群易位。正常情况下,肠管具有完整的屏障功能,使肠内的细菌和内毒素等物质被局限于肠腔内而不会转移到外周脏器。SAP发生后,由于肠道血供急剧下降,肠管发生缺血和低灌流状态,使对血流量高度敏感的肠黏膜屏障首先受损。肠内免疫物质分泌减少,肠粘膜上皮细胞及细胞间紧密连接被破坏,其结局是致病菌可能经受损肠黏膜屏障进入肠系膜淋巴结、门静脉、胰腺及远处脏器,引发败血症和全身多脏器感染,进一步加重了SAP的发展。因此,改善肠道的屏障功能可能是预防或改善SAP应激诱导的肠道功能障碍的新对策,如何维护SAP患者的肠屏障功能预防后期感染的发生是目前临床研究的重点和热点问题。 肠上皮细胞间的紧密连接与肠上皮细胞共同参与构成了肠粘膜屏障,其能够有效的阻止肠腔内分子量大于200Da的颗粒及某些亲水性分子通过肠上皮层。而Occludin蛋白是近年来发现的高表达于肠上皮细胞的重要蛋白,它是细胞间紧密连接的主要成分。有学者观察到在大鼠SAP早期即存在细胞紧密连接开放。但目前对于早期Occludin变化规律及其在调节细胞紧密连接功能上的作用的认识尚不十分清楚。因此,我们设计了本实验以初步探索SAP大鼠早期肠道粘膜屏障功能的变化及其与Occludin蛋白的相关性,以期为将来的临床诊疗提供有效的靶点。 本实验选用SD大鼠构建SAP动物模型,采用DAO、TUNEL等方法观察SAP早期肠道通透性、肠道上皮凋亡的改变以评价SAP发病早期(48h内)肠道屏障功能的变化情况。进而通过免疫组化、rt-PCR和Western Blotting等方法检测肠道Occludin表达的变化以初步探索其在SAP早期肠道粘膜屏障功能障碍中的作用,为临床治疗提供参考。全研究分为3个部分进行： 第一部分 SAP大鼠动物模型的建立 目的：通过逆行胰胆管注射制备大鼠重症急性胰腺炎模型,并评价模型的稳定性。 方法：将42只SD大鼠随机分成假手术组(18只)和SAP组(24只),每组等分为12h、24h、48h 3个亚组,采用胰管内逆行注射5％牛磺胆酸钠的方法制作动物模型。造模完成后通这血清淀粉酶检测以及胰腺病理学HE染色评价模型。 结果：内眼观察对照组腹腔没有明显改变,SAP大鼠腹腔可见扩张的肠管,肠间隙可见游离腹水,胰腺组织液化、出血等。胰腺病理HE染色显示,对照组小叶结构清晰,SAP胰腺组织小叶结构模糊,部分腺泡细胞坏死,间质充血,纤维组织增生,并随着时间进展而渐进性加重。其病理学评分证实SAP组胰腺病理改变显著重于同时间点假手术对照组,两者有显著性差异(假手术组1.08±0.66,SAP组12.33±0.93,P<0.01)。血清淀粉酶结果显示,SAP组12h升高,24h后达到高峰,48h仍维持在很高的水平,与假手术组大鼠相比有显著差异(假手术组2676±230u/l,SAP组9408±1256u/l,P<0.01)。 结论：胰管内逆行注射5％牛磺胆酸钠可成功诱导的大鼠SAP动物模型。模型诱发成功后胰腺炎病情呈渐进性发展且重复性及可比性好,适合SAP的发病机制和治疗学的研究。 第二部分 SAP早期肠道黏膜屏障功能的变化及其机制研究 目的：构建SAP大鼠模型,观察SAP发病早期肠道黏膜屏障功能的变化情况。 方法：将36只SD大鼠随机分成假手术组和SAP组,每组等分为12h、24h、48h 3个亚组,同第一部分制备SAP大鼠模型。分别于造模后12h、24h、48h留取血、胰腺、小肠组织,通过HE染色观察胰腺、小肠的病理变化,血清DAO检测以评价肠黏膜的通透性,Tunel法检测上皮细胞的凋亡。 结果：病理HE染色提示SAP12h肠黏膜结构形态大致正常、24h出现肠壁充血、水肿、伴少量炎症细胞浸润,而48h上述改变更加明显。血清DAO结果显示24h明显升高,与对照组相比有显著差异(SAP组为1.22±0.26,假手术组0.26±0.05,p<0.01)。肠上皮原位凋亡检测结果,SAP组48h肠上皮凋亡较对照组明显增加,分别为(SAP组63.3±6.1,假手术组8.3±1.8,p<0.01)。 结论:SAP早期随着肠道病理改变加重,肠道上皮细胞凋亡逐渐增加,并伴有肠道通透性增加等功能改变。 第三部分 SAP早期肠上皮细胞间紧密结合蛋白occludin的变化研究 目的：观察SAP早期大鼠肠道上皮闭锁蛋白Occludin的蛋白及mRNA表达变化,并分析其与病情的相关性。 方法：由第二部分中留取的小肠组织,采用免疫组化、rt-PCR、western-blot等方法观察比较假手术组和SAP组小肠上皮Occludin蛋白及mRNA的表达差异。 结果：①免疫组化结果显示SAP组Occludin表达较对照组明显降低,并随着病程的进展呈持续下降的趋势。与胰腺病理变化存在明显相关性。②rt-PCR结果显示大鼠肠道高表达occludin mRNA,SAP组12h无明显变化,但随病情进展,至24h开始下降,48h下降明显。③western blot半定量免疫印迹分析显示在65KD处大鼠各组小肠均表达Occludin蛋白,SAP组12h变化不明显,24h表现出下降趋势,至48h明显低于对照组,并随着病程的进展呈持续下降的趋势,与mRNA的变化趋势基本一致。 结论:SAP早期大鼠模型组小肠上皮Occludin表达水平下调,并随病情进展而持续维持在较低水平。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

摘要

引 言

第一部分 SAP大鼠动物模型的建立

一、材料

二、实验方法和步骤

三、结果

四、讨论

第二部分SAP早期肠道黏膜屏障功能的变化及其机制研究

一、材料

二、实验方法与步骤

三、结果

四、讨论

第三部分SAP早期大鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白Occludin的变化研究

一、材料

二、实验方法与步骤

三、实验结果

四、讨论

全文总结

参考文献

综述 重症急性胰腺炎肠粘膜屏障功能变化及其影响

论文与著作

致谢