GDNF受体RET与信号分子Rap1GAP相互作用及其功能的研究

摘要

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族包括GDNF、NRTN(neurturin)、ARTN(artemin)、PSPN(persephin)四个成员。它们不仅可以支持中枢神经系统中脑多巴胺能神经元与运动神经元等多种神经元的存活和发育,还支持许多外周神经元如交感、副交感、感觉与肠道神经元等的存活并调节其分化。除神经系统外,GDNF还是肾脏发育中的重要的形态形成因子,并在精原细胞分化过程中起关键的调节作用。目前发现的GDNF受体有三个:GFRα1、RET和NCAM,而RET是其最主要的功能受体。酪氨酸激酶类受体RET被GDNF激活后,发生二聚化和自磷酸化,继而募集下游信号分子,通过一系列的酶促级联反应,最终激活Ras/MAPK、P13-K以及PLCγ等信号转导通路,调控神经元的生长、分化、存活等生物学效应。 Rap1GAP可以和不同类型蛋白相互作用形成复合物。以往研究认为GPCR类受体Gao和Gai都分别能与Rap1GAP相互作用,Gao受体结合Rap1GAP,导致Rap1活化,而Gai与RaplGAPII结合则抑制Rap1活性,说明Rap1GAP和不同蛋白结合可以产生截然相反的效应。而以往对小G蛋白的GAP分子在RTK类受体信号通路的研究,发现RasGAP通过结合Dok2分子间接参与pTrkA和pEGFR信号的负调控,其通过抑制ERK途径的瞬时激活,负调控细胞的增殖效应；而Rap1/ERK在RTK类受体下游被持续激活,是参与神经营养因子调控细胞分化效应的保守途径,Sasagawa S等应用数学计算的方法,证明Rap1GAP在TrkA下游没有被pTrkA激活,其在胞浆一直保持基础的活性状态。所以至今尚无任何报导提出Rap1GAP可以参与调控RTK类受体下游信号转导。我们在前期研究中,用RET胞内域为诱饵经酵母双杂交筛选人脑cDNA文库,获得RET与Rap1GAP结合线索。本研究进一步探明RET与Rap1GAP是否确实存在生理结合,并探索二者结合的生物学意义,深入了解受体结合蛋白如何影响受体的定位和功能将有利于加速GDNF应用和发展的进程。 本研究的主要结果如下： 1、为了验证Rap1GAP和RET受体结合是否具有特异性,寻找关键结合区域,我们运用PCR方法扩增人源性Rap1GAP全长和各个主要区段(N段,GAP区,C段)cDNA,克隆入AD载体。通过酵母双杂交方法检测Rap1GAP与RET、TrkA、EGFR胞内域结合情况。结果表明,Rap1GAP全长与RET胞内域结合能力强,与TrkA结合微弱,与EGFR不结合；各个主要区段单独不能跟RET结合。β-半乳糖苷酶活力液相测活实验显示Rap1GAP全长与RET胞内域结合能力强,和系统阳性对照相仿。此结果为RET和Rap1GAP在体可能存在结合提供线索。 2、为了确证内源性两蛋白是否能够结合,首先用免疫印迹方法检测了RET和Rap1GAP在大鼠中枢神经系统各分区及细胞系中的表达,结果显示:Rap1GAP在成年大鼠中枢神经系统各分区广泛分布,PC12细胞系里也能检测到,只有3T3细胞里未检测到表达。而RET在成年大鼠中枢神经系统中的中脑,小脑,脊髓,下丘脑富含,皮层,海马,PC12,3T3细胞里未检测到。免疫共沉淀方法确证,在大鼠脑、脊髓组织裂解液中,内源性的Rap1GAP与RET能够发生结合。此结果为两蛋白可能存在生理结合提供有力证据。 3、为了明确RET和Rap1GAP在天然状态是否存在空间共定位,利用荧光免疫组织(细胞)化学方法,观察了RET和Rap1GAP在大鼠脊髓、中脑的分布。结果表明:RET在脊髓前角和后角边缘核中表达量高,Rap1GAP在脊髓呈现神经元特异性分布,RET和Rap1GAP在脊髓神经元内存在大量共定位。原代培养中脑神经元,观察单个细胞内两个蛋白分布情况,结果表明,Rap1GAP和RET在多巴胺神经元突起和胞体里都存在共定位。此结果说明两个蛋白存在生理结合,提示此结合可能具有重要生理意义。 4、为了确证两蛋白结合是否受配体调控,利用免疫共沉淀方法,检测GDNF刺激PC12-rGFRal-RET稳定细胞株后RET和Rap1GAP结合情况,结果显示二者结合在配体刺激后显著增强,说明二者结合是配体依赖性的,进一步提示Rap1GAP和RET结合参与调节GDNF引起的生物学效应。 5、为了探测两蛋白结合的生理意义,构建EGFP-Rap1GAP亚克隆,瞬时转染PC12-rGFRal-RET稳定细胞株,以空载体EGFP转染组做对照。结果表明,Rap1GAP过表达明显抑制GDNF诱导的细胞分化。为了进一步明确Rap1GAP蛋白的作用,我们设计并合成了三段siRNA序列,用western方法确定了有效沉默Rap1GAP基因的序列,之后将其转染细胞,用GDNF后刺激观察细胞分化效应。结果表明,敲减Rap1GAP基因表达后,GDNF诱导的细胞分化效应明显增加,说明内源性的Rap1GAP在GDNF诱导细胞分化过程中起到负性调节作用。 6、为了深入了解Rap1GAP与RET结合在神经系统的生理意义,分离培养大鼠胚胎14天中脑神经元,将Rap1GAP基因敲减或过表达,GDNF刺激3天后计量神经元最长突起的长度。结果显示,Rap1GAP过表达抑制GDNF诱导的神经元突起生长,而Rap1GAP基因敲减可以显著促进GDNF诱导的神经元突起生长。此结果说明,Rap1GAP对GDNF诱导的神经元的分化起到负性调控作用。 7、为深入探讨Rap1GAP发挥作用的机制,观察了GDNF下游主要信号通路的抑制剂对细胞分化效应的影响。结果表明,GDNF诱导Rap1GAP基因沉默细胞过度分化效应,可以被ERK信号通路抑制剂显著抑制。而将Rap1GAP基因过表达,GDNF刺激不同时间,western结果也显示,ERK的活化和Rap1的活化也受到抑制。以上结果表明,Rap1GAP蛋白对GDNF信号的调节,主要是影响了下游ERK途径。 8、为了明晰Rap1GAP是否通过其它机制调控GDNF信号通路,利用表达内源性RET,Rap1GAP,GFRal蛋白的SH-SY5Y细胞系,观察GDNF刺激后RET和Rap1GAP分布变化。免疫荧光细胞化学实验显示,GDNF不刺激情况下,Rap1GAP弥散分布在SH-SY5Y细胞胞浆里,RET大部分分布在细胞膜上。GDNF刺激SH-SY5Y细胞10分钟后,RET有大量内化现象,Rap1GAP和RET可以在同一早期内吞体里检测到；GDNF刺激细胞不同时间,用strepavidin-biotin沉淀细胞膜蛋白,western检测膜蛋白里RET的剩余量。结果显示,Rap1GAP过表达情况下,GDNF刺激细胞后,RET在细胞膜内表达维持时间最长,GDNF刺激15分钟后膜上仍能检测到RET:而Rap1GAP沉默组,GDNF刺激5分钟后,细胞膜里几乎检测不到RET。以上结果说明,Rap1GAP的表达量明显影响GDNF引起的RET内化过程。 9、为了明确Rap1GAP介导的Rap1活性抑制在调制GDNF信号转导中的作用,我们构建丧失抑制Rap1活性的突变EGFP-Rap1GAP(N290A)和pB42AD-Rap1GAP(N290A)。将EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP分别转染细胞,KCL刺激后,检测细胞裂解液中Rap1活性,结果显示我们构建的EGFP-Rap1GAP(N290A)突变体确实丧失了抑制Rap1的催化活性作用。酵母双杂交β-半乳糖苷酶活力检测,突变体Rap1GAP(N290A)和野生型Rap1GAP与RET结合能力类似。构建EGFP-Rap1GAP(N290A)质粒,并和EGFP-Rap1GAP分别转染细胞,免疫共沉淀结果证明,Rap1GAP(N290A)和RET结合在GDNF刺激后结合增强。以上结果提示,Rap1GAP与RET结合不依赖GAP区的催化活性。 10、为了明确缺失GAP催化活性后,Rap1GAP对GDNF效应的影响,我们将EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP分别转染SH-SY5Y、PC12-rGFRαl-RET细胞系或者大鼠中脑神经元,GDNF刺激三天后,荧光拍照检测细胞突起延伸情况。统计结果显示,EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP具有相似的抑制细胞分化的作用,二者之间的微弱不同不足以引起统计学差异。转染EGFP-Rap1GAP(N290A)或者EGFP-Rap1GAP,GDNF刺激细胞不同时间后,检测细胞裂解液中Rap1和ERK活性。结果显示,两者抑制下游ERK、Rap1活性的效果相类似。此结果说明Rap1GAP抑制GDNF引起的细胞分化效应和ERK的激活,并不依赖其GAP区的催化活性。免疫荧光实验和biotin实验结果表明,EGFP-Rap1GAP(N290A)过表达,抑制GDNF诱导的RET内化作用。说明EGFP-Rap1GAP(N290A)抑制RET内化作用是其发挥抑制细胞分化效应的主要机制。 综上所述,本研究首次提出调节RET受体内化和转运的蛋白-Rap1GAP并证明Rap1GAP阻止RET内化作用是其发挥抑制GDNF/RET诱导的细胞分化效应的主要机制。 以上结果未见文献报导。

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