肝癌中少量SP表型细胞富集类肿瘤干细胞特性及与新型干细胞标志ABC转运体家族成员ABCG2相关性研究

摘要

本课题旨在建立一种干细胞(stem Cells)、肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells)研究模式。完成一种干细胞株hEFMSCs的分离、鉴定、定向诱导分化的工作,研究结果发现在体外特定的培养条件刺激下,hEFMSCs可诱导成神经细胞、脂肪细胞、肝细胞样细胞,提示hEFMSCs是一种增殖速度快、免疫原性低、可塑性高的可为细胞移植治疗提供种子细胞的干细胞。 在干细胞株hEFMSCs的研究基础上,经过长期反复摸索从肝癌细胞系、肝癌病人组织标本及乳腺癌肿瘤细胞系中检测到极少量SP(Side Population)细胞的存在,含量从0.3％至0.8％不等。从肝癌细胞系分选出的SP、Non-SP细胞移植于Nod-Scid鼠,发现103个SP细胞具有高致瘤性,而接种103个Non-SP细胞无一成瘤。结合其它研究结果提示肝癌中存在的少量SP表型细胞富集了类肿瘤干细胞的特性。进一步探究了肝癌中SP表型细胞的分子机制,通过与ABC转运体家族基因ABCG2等的相关性研究,提示肝癌SP细胞可能与ABC转运体成员ABCG2的高表达有关。 一.研究背景及意义: 干细胞时代已经到来。干细胞是一类具有自我更新能力且同时具有高度分化潜能的细胞。干细胞保持着旺盛的增殖能力,通过不对称分裂诱导产生祖细胞和成熟细胞。在特定的条件下,它可以分化成多种功能细胞或组织器官。 目前已从不同种属的受精卵、胚胎或成体等的分离出多种内胚层、间充质、外胚层来源的干细胞。干细胞的研究炙手可热,1999年Jackson等在《美国科学院院报》上发表小鼠肌肉细胞的干细胞可以在受照射鼠体内分化为血液细胞,各国学者也均陆续报道了从成体动物和人的骨髓、脐带血中分离出可以诱导为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经等细胞的干细胞,提出了干细胞跨系甚至于跨胚层分化的可塑性(Plasticity)。2007年shinya等陆续报道成体细胞可以逆分化为胚胎干细胞的新发现又一次引起全球轰动。 如何分离、寻找、获取高纯度的干细胞显得尤为重要,但干细胞缺乏高度特异性的表面标志为研究设置了一大难题。1996年,Goodell等人在用DNA染料Hoechst33342为干细胞染色并进行流式细胞仪分析时,发现有一群细胞染色偏低,和其它大部分细胞不一样,遂命名为横向群体细胞。这部分细胞占骨髓细胞的0.05％,其中富含造血重建细胞。Hoechst33342是一种亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,与DNA特异性结合,它主要结合在富含AT区域的DNA小沟部分。结合DNA后荧光大大增强,最大激发光波长约为350nm,最大发射光波长约为461nm,可用于活细胞观察,不需要对细胞作固定及透化处理。利用造血干/祖细胞能将荧光染料Hoechst33342和罗丹明123泵出细胞外的特性,结合流式细胞术进行分离纯化,已成为一种经典的分离干/祖细胞的方法。 近几年,乳腺癌干细胞(AL-Hajj,2003),脑瘤干细胞(Singh,2003)以及慢性髓系白血病干细胞(Hope K J,2004)的发现不断证明着肿瘤干细胞假说的正确性：肿瘤中存在着肿瘤干细胞,只有少部分肿瘤干细胞才有成瘤能力并维持肿瘤表型,提示实体肿瘤是一种干细胞疾病的新观点正在被人们接受。2006年,Tetsuhiro等发现肝癌细胞系中存在少量SP细胞,Nod-scid鼠接种103量的SP细胞能够成瘤,而接种106量的Non-SP细胞不能够成瘤,推断肝癌SP细胞可能是肿瘤干细胞。 研究发现,SP细胞能够泵出荧光染料Hoechst33342的能力主要是通过其细胞膜上的ATP-Binding Cassette f(ABC)Transporter Superfamily-ABC转运超家族实现的,内源性化合物和异质物主要通过被动扩散和转运体的转运而进出细胞膜。目前跟肿瘤干细胞有关的成员主要聚焦在MDR1、乳腺癌耐药基因ABCG2、ABCB5,此外还可能包括MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、MRP7、ABCC11和ABCC12等。肝癌组织中的肝癌细胞是不均质的,它们之间存在着分化和增殖能力的差别,具有多向分化潜能和高增殖力的肝癌细胞很可能是“肝癌干细胞”。由于肿瘤普遍存在着耐药性现象,而耐药性产生的机理又与SP表型产生的机理相同,并且SP细胞和癌干细胞在肿瘤细胞中所占的比例都很小,所以,推测具有SP表型的肿瘤细胞很可能是癌干细胞。 肿瘤干细胞的发现对认识肿瘤带来了全新的观念,提示我们可能离肿瘤的真相更近了一步,也为临床彻底根治肿瘤展示了新的希望。相信随着对肿瘤干细胞研究的深入,将寻找出肿瘤干细胞的特异性靶位,研制出新的针对肿瘤干细胞的药物,向攻克肿瘤的目标迈进。 二.研究内容及结果: (一)分离、鉴定了人早期胎儿组织来源的间充质干细胞株hEFMSCs,为SP研究提供-种干细胞模板：1.分离、纯化、培养、建立了一种人早期胎儿组织来源的细胞株,流式分析其表型为CD13+、CD29+、CD90+、CD106+、SH2+、CD3-、CD4-、CD5-、CD11b-、CD14-、CD15-、CD34-、CD45-、CD45RA-、CD133-、HLA-DR-。2.在体外特定培养条件下该细胞可被诱导成类肝细胞,提示可能为临床肝衰竭细胞移植治疗提供一种新的肝细胞来源。3.经生物学性状、细胞周期、表型、定向诱导分化能力等一系列检测,提示此细胞为一种较成体干细胞更加原始,增殖速度快,免疫原性低,可塑性高的多潜能间充质干细胞。鉴于此,遂将此细胞株命名为hEFMSCs(human Early Foetus-derivedMesenchymal Stem Cells)。 (二)分离出高纯度的sP细胞决定了后续研究结果的可靠性。经长期反复摸索建立了SP检测分选研究体系及其效率评价,包括检测多种类型细胞的SP含量,并对从肝癌细胞系中纯化出的SP细胞进行肿瘤干细胞性质鉴定；主要发现：1.在PLC、Huh7、Hep3B、SMMC7721及1例临床肝癌组织中检测到SP细胞,含量依次为0.8％、0.3％、0.6％、0.3％、0.4％；未在HepG2、hEFMSCs中检测到SP细胞；2.PLC-SP(0.8％)细胞、SMMC7721-SP(0.3％)细胞富集了类肿瘤干细胞的特性。 (三)初步研究了SP表型与ABC转运体超家族成员ABCG2的相关性,从RNA水平上分析了临床肝癌样本中ABCG2的表达差异。推测肝癌SP细胞泵出Hoechst33342的能力可能主要是通过ABC转运体家族ABCG2实现；干细胞株hEFMSCs中不含SP表型细胞可能与ABCG2的低表达有关,以上推论仍需进一步验证。 本课题总体框架： 1.hEFMSCs的建株、鉴定及定向诱导分化,证明hEFMSCs为干细胞。(分离建株；形态学；表面标志；脂诱导及鉴定；神经诱导及鉴定；肝诱导及鉴定)。 2.肝癌中存在的少量SP表型细胞富集类肿瘤干细胞特性。(SP细胞检测；SP分选；体系的评价；长期培养形态对比；NonSP超微结构；周期检测；Nod-Scid荷瘤实验)。 3.ABC药物转运体家族基因ABCG2在肝癌中表达及其与SP表型细胞的相关性(ABCG2在多种细胞中的表达情况；SP、NonSP细胞中ABCG2mRNA表达水平；肝癌标本癌及癌旁ABCG2表达水平)。 主要发现、结论及推论： 1.肝癌中存在少量SP表型细胞； 2.肝癌中0.8％含量的PLC-SP细胞及0.3％含量的SMMC7721-SP细胞富集了类似肿瘤干细胞的特性； 3.肝癌SP细胞泵出Hoechst33342的能力可能主要由ABC转运体家族ABCG2实现； 4.干细胞株hEFMSCs中不含SP表型细胞可能与ABCG2的低表达有关； 5.SP表型可能只是肿瘤干细胞的一个高度浓缩。 尚待回答的问题： 1.SP在肝癌HepG2细胞中未检测到的原因? 2.SP表型与CD133阳性表型有否关联? 3.SP与ABC转运体家族ABCG2的关系是什么? 课题特色及创新点： 1.分离和鉴定了一种人早期胎儿组织来源的干细胞株hEFMSCs； 2.建立了稳定性、可靠性、重复性较好的肝癌SP细胞检测纯化研究方法； 3.从认识干细胞的更新与分化性质入手,将肿瘤与干细胞联系了起来。

目录

论文说明：缩略语

声明

前 言

第一部分 人早期胎儿组织来源的间充质干细胞株hEFMSCs的分离、鉴定及体外定向诱导分化的研究

第二部分 肝癌中SP表型细胞检测及纯化的SP细胞富集类肿瘤干细胞特性的研究

第三部分 一种新型干细胞标志-ABC药物转运体家族成员ABCG2在肝癌中的表达及其与SP表型细胞的相关性研究

全文总结

文献综述肿瘤干细胞：可能离肿瘤的真相更近了一步

致 谢