乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的病理及免疫学特征研究

摘要

人类乙型肝炎病毒(hepatic B virus,HBV)是一种嗜肝非细胞毒性DNA病毒。根据外膜蛋白上氨基酸序列的不同,HBV至少可分为四种血清亚型:ayw、adr、ayr和adw,在我国主要以adr亚型为主。 HBV感染严重威胁着人类的健康,目前全世界大约有3.5亿人感染HBV,尤其在亚洲和非洲其感染率很高。在我国HBV的感染率约为10％,现有大约3000万慢性乙型肝炎患者。由于每个人的体质不同,所以人类乙型肝炎病毒导致的肝病严重程度也不一样。有些人在感染乙肝后能在没有明显临床病症的情况下从血液中清除病毒,或者在感染急性肝炎的情况下痊愈而不留下长期的临床后遗症；而有些患者就不能清除病毒并发展为慢性感染,大多数慢性感染患者处于无症状状态而没有生命危险,10-30％患者发展为肝硬化并可能进展为肝癌。由于缺乏比较理想的HBV感染模型,严重制约了对HBV发病机制和抗病毒治疗的深入研究。 研究能够表达HBV基因或复制整个病毒基因组的一些动物模型,比如与肝DNA病毒属感染相关的动物模型以及转基因小鼠模型,能够使我们对HBV感染有更好的认识。此外,在活体外通过对人和黑猩猩抗原特异T细胞的直接量化来分析免疫现象的能力也能够增加我们对于HBV发病机理的认识。HBV转基因小鼠对研究乙肝的发病机制起了极大的推动作用,国内外学者相继建立了一些比较理想的乙肝转基因动物模型。 本实验室自1992开始,相继研发了多种品系的乙肝转基因小鼠,其中整合双拷贝的全长HBV基因组DNA(adr亚型)的乙肝转基因小鼠C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU“3号”品系具有类似慢性无症状HBV携带者(chronic asymptomatic HBV carrier,AsC)的多种生物学特性。这一品系的主要特点有:HBV基因在小鼠基因组中整合并稳定遗传；血清HBsAg、HBeAg阳性；抗HBs和抗HBe均阴性；肝组织中有HBsAg、HBcAg、X蛋白表达；血清中存在HBV DNA,肝组织中存在病毒样颗粒。但与以往研究结果不同,部分转基因小鼠肝组织出现了轻重不等的病理学改变。 本课题利用我们实验室建立并优选的乙肝全基因组转基因小鼠C57-TgN(HBVdr2.0)SMMU“3号”品系的F14-F20代小鼠为实验对象,从蛋白质、病理学和免疫学角度,综合分析该品系转基因小鼠的免疫病理学特性,使其成为可应用于乙型肝炎病毒相关研究的实验动物模型。 通过130例SPF级乙型肝炎转基因小鼠和10只同龄正常C57BL/6小鼠肝组织进行HBsAg表达、H-E染色和浸银染色分析,光镜观察,并按病理改变严重程度、月龄等分组,分析肝脏病变、月龄、性别、HBsAg表达等因素之间的关系。结果显示： 与对照小鼠相比,转基因小鼠肝组织出现了类似人慢性乙型肝炎携带者的病理改变,60.77％(79/130)的乙肝小鼠出现比较明显的肝细胞变性坏死、单个核细胞浸润和纤维增生。不同月龄组的转基因小鼠肝组织学表现各不相同,且与月龄正相关。而肝组织的病理改变与性别、病毒蛋白的表达并无相关性。这些结果表明,转基因小鼠发生了与人类慢性HBV无症状携带者相似的肝组织病理性损伤,总体为轻度慢性肝炎。选取出现单个核细胞浸润的肝组织进行免疫组织化学检测发现,肝组织中浸润的单个核细胞大多为CD3+、CD4+T细胞。 通过本课题的研究提示我们：我们实验室建立的C57-TgN (HBVdr2.0)SMMU“3号”品系乙肝全基因组转基因小鼠肝脏产生类似慢性无症状HBV携带者的病理学变化,病理改变与病毒蛋白表达无相关性,与小鼠月龄呈正相关性。CD3+、CD4+T细胞参与了肝脏损伤的过程。本研究证实该品系转基因小鼠可作为人类慢性无症状HBV携带者的实验动物模型,用来探讨人类AsC的发病机制及其防治研究。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前 言

实验材料

一、实验动物

二、主要试剂及配制方法

三、主要仪器设备

实验方法

一、组织切片和H-E染色

二、网状纤维染色

三、HBV在转基因小鼠中蛋白水平的表达

四、T淋巴细胞亚群的免疫组化原位鉴定

五、统计学分析

实验结果

一、乙型肝炎病毒蛋白在转基因小鼠肝组织中的表达

二、乙型肝炎转基因小鼠的病理学变化

三、转基因小鼠肝组织中白细胞分化抗原的检测

讨 论

一、不同方法制备的HBV小鼠模型的分析

二、乙型肝炎病毒转基因小鼠的病理学分析

三、乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫学分析

三、乙型肝炎转基因小鼠的应用前景

综述：肝纤维化发生机制的研究进展

一、HSC与肝纤维化

二、ECM与肝纤维化

三、MMPs、TIMP与肝纤维化

四、细胞与肝纤维化

五、细胞因子与肝纤维化

六、结语

参考文献

致谢