Ⅰ型胶原复合聚乳酸支架体外培养兔关节软骨的实验研究

摘要

关节软骨损伤和缺损一直是骨科临床治疗的一个难题,一些方法：如骨膜移植、微骨折术、细胞移植、骨软骨移植以及局部应用成软骨的生长因子等,都在一定程度上为这一难题的解决提供了可行方案,但又都有相应的局限性。构建组织工程人工软骨的途径来修复软骨损伤被认为是一种较理想的方法,但其发展也同样面临软骨细胞增殖能力弱和去分化等问题的困扰。多数研究者采用种子细胞与单一的支架材料的方法构建出组织工程软骨,并在动物组织缺损修复的实验中取得成功。这些成果证实了组织工程技术的可行性和巨大的临床应用前景,但同时也表现出这种单一、简单构建方式的不足,其构建的组织的体积、形态、生物学表现等与生理状态下有极大的不同,不能满足临床应用的实际需要。对此,采用与正常生理状态类似的环境(生物环境、力学环境)进行构建是更为重要的领域。单一的人工材料支架如聚乳酸支架存在亲水性、细胞粘附性差等缺点,I型胶原可以改善聚乳酸支架的亲水性、细胞粘附性,且来源于胎牛皮肤的I型胶原对维持软骨细胞表型,促进其合成细胞外基质具有显著的影响。研究复合材料支架对人关节软骨细胞分化增殖的影响,体外培养具有更好的生物学性状的组织工程软骨以治疗软骨损伤具有重要的理论及现实意义。 目的： 1.探讨解决软骨细胞体外增殖过程中的去分化及增殖率下降问题。 2.研究I型胶原复合聚乳酸支架三维培养条件下关节软骨细胞增殖能力及表型稳定性等生物学行为变化。 3.探讨体外培养条件下软骨细胞-支架复合物向软骨组织转化的可行性及有效途径。 方法： 1.软骨细胞的来源：取四周龄新西兰兔,超净台内无菌条件下片状切取双肩、双膝、双髋关节软骨,用机械和酶消化法获得单个软骨细胞,制成细胞悬液。 2.软骨细胞的体外单层及三维培养：首先对取得的兔关节软骨细胞行单层培养。取第二、三代单层培养细胞分别转入聚乳酸、Ⅰ型胶原复合聚乳酸支架三维培养体系。 3.三维培养下软骨细胞增殖情况的检测:A)采用细胞计数法分别测定两种支架培养体系中软骨细胞增殖情况。B)绘制细胞生长曲线,以研究各实验组在短期内的细胞增殖情况的差异。 4. 软骨细胞的鉴定：采用HE染色及显微镜下观察细胞形态,对软骨细胞特异性分泌产物Ⅱ型胶原的免疫组化、AB-PAS染色观察,鉴定软骨细胞来源,用改进的二甲基亚甲蓝(DMB)比色法测定细胞外基质的糖胺多糖含量。 结果： 1、在一定培养条件下,兔关节软骨细胞经单层传代培养扩增,可在短时间内获得多量、性状稳定的软骨细胞,第2、3代和原代软骨细胞形态相近,并可分泌基质胶原和蛋白多糖。第4代开始出现去分化现象,第5代后软骨细胞出现较严重去分化现象,第7代基本停止生长。 2.聚乳酸支架载体具有网眼状孔隙结构,孔隙直径为120～180um,软骨细胞可结合于载体的网状孔隙内并呈团簇状生长。 3.三维培养条件下软骨细胞增殖成团簇状,Ⅰ型胶原复合聚乳酸支架组的细胞计数水平及细胞集落高于单一聚乳酸支架组；复合支架组的糖胺多糖含量高于单-聚乳酸支架组。 4.聚乳酸支架组培养第5代时,部分组织切片Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阴性；第8代时,组织切片Ⅱ型胶原免疫组化检测呈阴性；Ⅰ型胶原复合聚乳酸支架组的第8代软骨细胞特异性Ⅱ型胶原仍呈强阳性表达,HE染色显示细胞形态为圆形,培养细胞保持了良好的分化表型。 结论： 1.关节软骨细胞的单层培养扩增可为组织工程研究提供足量的、生物学性状良好的种子细胞。 2.聚乳酸支架载体初步具备作为软骨细胞载体的条件,可用于软骨组织工程的研究。 3.I型胶原对维持软骨细胞表型,并促进其合成细胞外基质具有显著的影响,I型胶原复合聚乳酸支架体外三维培养关节软骨细胞较单一聚乳酸支架优越。 4.I型胶原复合聚乳酸支架体外三维培养体系可有效保持透明软骨细胞表型的稳定,促进软骨细胞增殖及基质合成,可为关节软骨组织工程研究提供一种有效的途径。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

详细摘要

详细英文摘要

第一部分软骨细胞的分离、单层培养及鉴定

前言

摘要

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、本部分实验结论

五、附图

第二部分Ⅰ型胶原复合聚乳酸支架的构建及软骨细胞在单一聚乳酸支架及复合材料支架上的培养与检测

前言

摘要

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、本部分实验结论

五、附图

全文小结

参考文献

文献综述 软骨细胞培养的影响因素

在读期间发表论文及参加科研式作情况

致 谢