190CT3多肽调节白血病细胞增殖分化的实验研究

摘要

研究背景和目的：白血病是起源于造血干细胞的恶性疾病,俗称血癌。白血病细胞具有肿瘤细胞的生长特点：增殖失控、分化障碍、凋亡受阻,白血病细胞大量增生累积,而使得正常造血功能受到抑制,至今无有效治疗方法。目前,科学家提出人体所有疾病都可以从信号转导异常的角度重新认识,细胞信号转导机制和各种疾病发生机制的阐明,使得很多信号分子可以作为治疗这些疾病的药物筛选靶位,由此产生了信号转导药物。 白血病抑制因子是一种细胞因子,最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤细胞条件培养液中被纯化,因其能够诱导白血病细胞株M1细胞向正常细胞分化,故称白血病抑制因子。LIF因子是一种多功能的细胞因子,它能够抑制HL-60,K562,U937等白血病细胞的增殖。同时LIF对于干细胞的增殖分化也有广泛的调节作用,最典型的生物学功能是抑制胚胎干细胞的分化,维持其增殖和干细胞的多能性。LIF的生物学效应是其首先与LIF受体的a亚基(gp190)结合,并使之与另一β亚基(gp130)结合,形成异源性二聚化结构,从而启动细胞内信号转导通路使胞外的信息传入核内,调控特定基因的表达,使细胞发生一系列的变化。在LIF调节白血病细胞增殖分化的过程中,JAK-STATS信号转导通路是LIF产生活性的重要途径,而在众多的STATS分子,STAT3信号分子的激活与调节白血病细胞的分化最为密切。 gp190(LIFRα亚基)是低亲和力的LIF特异性受体,属于造血细胞受体超家族,其缺乏内生激酶的活性。生理状态下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR。可溶性受体,游离于胞外,没有跨膜区和细胞内区。跨膜的LIFR(gp190)胞内区含有三个功能域--BOX1、BOX2和BOX3。YXXQ结构是激活细胞内信号转导的必需序列,位于远膜端(Y酪氨酸,X任意氨基酸,Q谷氨酰胺),它能与STAT3的SH2位点特异性识别结合,是STAT3磷酸化的必须结构。Hermanns证实LIF受体a亚基细胞内区近膜端与STAT3结合,远膜端激活STAT3。Tomida等研究发现,LIFR gp190亚基胞内区具有信号传导的功能。有关膜受体信号启动位点的游离多肽对细胞增殖分化的影响也已有相关的报道,单一亚基的单一信号启动位点在离膜状态下完全能够在细胞内启动相应的信号转导通路。 在我们以往的研究工作中发现,在没有LIF因子的诱导下,高表达的LIFRa亚基也可使白血病细胞下游的信号转导通路激活。按照LIFRa亚基细胞内区第三个功能域(Box3)设计一种小分子--190CT3,并使其在白血病细胞内表达,通过检测JAK/STAT3及P44/42 MAPK信号转导通路下游信号分子及其磷酸化水平,研究发现其确实具有LIF受体的信号启动效应从而抑制白血病细胞的生长。通过动物裸鼠体内实验,结果发现,HL-60-190CT3细胞株注射的裸鼠与其他两组(HL-60和HL-60-3.0细胞)相比脾脏、肾脏、肝脏以及肺等组织内的肿瘤细胞增生、充血水肿明显减少,HE染色后显微镜下观察发现：多个器官血管增生和淋巴细胞浸润现象明显低于其他两组,证明其转染了目的基因190CT3的白血病细胞毒性明显降低。 本实验研究目的着重于鉴定并明确190CT3多肽的活性和功能,制备并获取190CT3多肽,进一步为成功研制对白血病细胞有较特异杀伤作用的新的生物学药物提供临床应用依据。 研究方法：本实验首先获得了重组190CT3和190CT3-myc两种CHO表达细胞株,以高效表达目的基因的CHO细胞作为蛋白供体。将获得高效表达目的基因的CHO细胞株与HL-60细胞共培养。利用RT-PCR,免疫荧光细胞化学、westernblot,流式细胞仪,AO/EB,Annexin-V/PI,激光共聚焦等生物学实验方法,从细胞形态观察,蛋白表达量高低的鉴定,分子磷酸化水平等方面分析细胞形态学变化、细胞增殖核抗原(PCNA)和粒细胞表面抗原CD15在共培养后白血病细胞的变化,分析190CT3多肽是否可以启动白血病细胞下游的信号转导,进而抑制白血病细胞的增殖并促进其在一定程度的分化。另一方面我们也通过细胞凋亡实验,排除了其诱导白血病细胞凋亡的作用。并通过亲和层析的方法分离纯化获得190CT3功能多肽。 结果发现：1)构建190CT3-mvc cDNA表达载体：藉HindⅢ和Xba I位点将目的片段重组于T载体中。然后转化入DH5a中,涂平板、挑克隆,用HindⅢ和XbaI酶切鉴定,证实重组质粒中含有预期大小的片段(400bp左右),挑选含有插入片段的重组子T-190CT3myc进行测序,且无碱基突变。将目的片段酶切后重新连入真核表达载体pcDNA3.0中,成功构建重组pcDNA3.0-190CT3myc的真核表达载体。2)通过脂质体转染,将空载体和两种重组子分别导入处于对数生长期的CHO细胞,G418筛选(终浓度2800ug/ml),挑选G418阳性克隆。成功构建了三种细胞株:pcDNA3.0-190CT3重组子CHO细胞株(CHO-190CT3)、pcDNA3.0-190CT3myc重组子CHO细胞株(CHO-190CT3myc)、pcDNA3.0 CHO细胞株(CHO-3.0);3)RT-PCR检测到190CT3在mRNA水平上的表达。挑取表达目的基因比较高的细胞株继续扩大培养,细胞免疫荧光化学和westernblot均检测到190CT3多肽的表达,而转染pcDNA3.0空载体的CHO细胞未检测到190CT3多肽的表达。共培养后白血病细胞的形态学改变:CHO-190CT3细胞株与HL-60和K562细胞共培养1周后,共培养后的HL-60和K562细胞与野生型HL-60细胞相比细胞体积变大,形状变得不规则,K562细胞呈明显的气球样变。而与CHO-3.0细胞株共培养1周后的HL-60和K562细胞形状规则,变化不明显。4)Western blot检测细胞核增值抗原PCNA的表达水平,与CHO-190CT3共培养的HL-60细胞株PCNA的表达水平低于其他两组；4)流式细胞仪检测粒细胞表面抗原CD 15发现,与CHO-190CT3共培养的HL-60和K562细胞CD15阳性细胞百分数均高于其他两组细胞；5)westernblot检测下游信号分子STAT3和STAT3磷酸化水平发现与CHO-190CT3共培养HL-60细胞组与其他两组细胞相比,STAT3及其磷酸化水平升高；激光共聚焦显示较强于其它两组的阳性信号并且有STAT3信号分子入核。6)吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)和Annexin-V/PI双染色实验检测细胞凋亡情况,三组细胞均未见有明显的凋亡现象。因此排除了190CT3多肽对白血病细胞的促凋亡作用。 本研究结果表明：190CT3重组子可以在CHO细胞中表达,通过与白血病细胞共培养的方法,检测JAK/STAT3信号传导通路下游的信号分子,STAT3及STAT3磷酸化水平,结果显示二者表达均增高,JAK/STAT3信号传导通路激活；初步证明了190CT3多肽可以激活下游的信号分子,抑制白血病细胞的增殖,促进其分化。通过该研究,我们明确了190CT3多肽性质稳定,可以通过激活细胞内相关信号转导通路,调节白血病细胞的增殖分化；本实验为信号转导分子机制研究转向临床应用研究的一次尝试,以期为临床白血病的治疗提供一条新的途径。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

第一部分190CT3多肽对白血病细胞增殖分化的调节功能

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

五、参考文献

第二部分190CT3-myc的蛋白纯化及蛋白活性的功能鉴定

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、参考文献

全文小结

综述 PTD蛋白跨膜转导信号肽

发表文章 LIF受体胞内功能域调节白血病细胞增殖分化

致 谢

附录 研究生期间已发表论文和参加会议