器官培养保存角膜及大泡性角膜病变Na-K-ATP酶活性及水通道蛋白-1表达的改变

摘要

目的: 一、检测器官培养法保存角膜Na+-K+-ATP酶活性和水通道蛋白-1表达的改变，探讨Na6+-K+-ATP酶活性和水通道蛋白-1表达的改变在保存角膜水肿中的作用。 二、以0.05％的新洁尔灭溶液前房注射制作兔眼大泡性角膜病变的动物模型，检测Na+-K+-ATP酶活性和水通道蛋白-1的表达，探讨Na+-K+-ATP酶和AQP-1在大泡性角膜病变发病机制中的作用。 三、以器官培养法保存的角膜为供体行穿透性角膜移植术治疗实验性大泡性角膜病变，观察角膜透明、厚度等恢复情况，了解术后角膜CEC存活情况能否满足PKP的要求。 方法: 一、本实验分为2组，24只新鲜兔眼角膜作为对照组，24只器官培养保存的角膜作为实验组。两组均在眼球摘除前以角膜测厚仪测量角膜厚度，眼球摘除后以非接触角膜内皮显微镜行角膜内皮细胞计数。实验组经器官培养保存4周后以角膜测厚仪测量角膜厚度，然后每个角膜被分成两半，共48个半片角膜，再分成4组，每组12个半片。12个半片用茜素红.台盼蓝染色染色行角膜内皮细胞计数；12个半片角膜用4％中性福尔马林溶液固定行HE染色、应用免疫组化染色检测AQP-1在角膜基质和内皮细胞表达的改变；12个半片角膜用Na+-K+-ATP酶试剂盒测量角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性；12个半片角膜用实时荧光定量PCR检测AQP-1mRNA表达改变。实验组角膜厚度和角膜内皮细胞计数进行保存前后的比较。实验组Na+-K+-ATP酶活性、免疫组化染色及实时荧光定量PCR检测AOP-1表达的改变，与正常对照组角膜比较。 二、以0.05％的新洁尔灭溶液前房注射制作兔眼大泡性角膜病变的动物模型，制模前分别用角膜测厚仪和角膜内皮显微镜测量角膜厚度和角膜内皮细胞数目。术后观察眼球大体情况、测量角膜厚度。1周后处死实验动物取角膜，用茜素红.台盼蓝染色染色行角膜内皮细胞计数；用4％中性福尔马林溶液固定行HE染色、应用免疫组化染色检测AQP-1在角膜基质和内皮细胞表达的改变；用Na+-K+-ATP酶试剂盒测量角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性；实时荧光定量PCR检测AQP-1mRNA在角膜内皮细胞表达的改变；并于正常对照组角膜比较。 三、以0.05％的新洁尔灭溶液前房注射制作兔眼大泡性角膜病变的动物模型，制模7天后，用器官培养法保存4周的角膜作为供体行穿透性角膜移植术。观察术后植片透明度、以角膜测厚仪测量角膜厚度。PKP术后14天摘取移植植片，行茜素红-台盼蓝染色染色检查角膜内皮存活情况。 结果: 一、器官培养保存4周后角膜厚度明显增厚水肿，角膜厚度由保存前的351.12±23.23μm增厚至保存后683.60±48.92μm；内皮细胞密度由2742.61±124.02个/mm2减少为2381.56±174.27个/mm2；Na+-K+-ATP酶活性在新鲜角膜为3.82±0.27U/mgprot，在保存角膜降低为3.58±0.26U/mgprot；HE染色显示保存4w时角膜上皮仅剩余1～2层细胞，基底细胞规则的柱状结构消失，基质仍轻度水肿，后弹力层有较多皱折；免疫组化法检测到AQP-1在角膜的内皮细胞与基质有阳性表达，保存后角膜内皮、基质的棕黄色变淡，表达降低；实时荧光定量：PCR结果显示保存后角膜内皮细胞的AQP-1mRNA相对于保存前的表达呈下降趋势。 二、实验性大泡性角膜病变的角膜水肿混浊，明显增厚，第7天时平均达到696.17～43.54μm；角膜内皮细胞密度由制模前的2876.00±164.65个/mm2减少到646.58±126.72个/mm2；CEC染色见内皮细胞片脱落，细胞失去正常六边形外观、不规则，细胞膜破裂溶解。Na+-K+-ATP酶活性明显降低至1.03±0.28 U/mgprot；HE染色组织学观察内皮层不完整，细胞数目较少，部分脱落，上皮下有水泡形成；免疫组化法检测到AQP-1在角膜内皮的着色变淡，部分区域无阳性染色，基质的染色变淡。 实验性大泡性角膜病变角膜内皮AQP-1mRNA相对于正常的表达呈明显下降趋势。 三、术后第一天，植片基本透明，可以看清瞳孔和虹膜，术后第三天植片完全透明，可以看清虹膜纹理；角膜缘充血及结膜充血3天后逐渐减轻，但轻度充血一直存在。术后第一天，植片轻度水肿，厚度开始变薄；术后第三天，植片水肿消退，厚度已基本恢复到保存前水平；术后7天植片厚度较保存前略薄；术后14天仍较保存前薄。PKP术后角膜植片CEC密度较保存后略有下降，不规则的细胞形态减少。 结论： 一、器官培养法保存的角膜厚度增加，内皮密度降低，Na+-K+-ATP酶活性轻度下降，水通道蛋白-1的表达降低；保存后细胞密度能满足角膜移植的要求；保存的角膜水肿可能与Na+-K+-ATP酶活性和内皮AQP-1表达降低有关。 二、以0.05％的新洁尔灭溶液前房注射可以建立兔眼大泡性角膜病变的动物模型，Na+-K+-ATP酶活性和内皮AQP-1表达降低与大泡性角膜病变的发病有关。 三、器官培养保存兔角膜在行PK术后植片透明，能够满足治疗大泡性角膜病变的PKP手术要求。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引言

第一部分 器官培养法保存角膜的Na+-K+-ATP酶活性和水通道蛋白-1表达的改变

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 实验性大泡性角膜病变Na+-K+-ATP酶活性和水通道蛋白-1表达的改变

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 器官培养保存角膜行穿透性角膜移植治疗实验性大泡性角膜病变的研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

文章插图

角膜保存方法研究进展

水通道蛋白在眼科的研究进展

论文发表情况

致谢