器官培养法保存角膜的内皮细胞活性研究及在基因转染和移植排斥研究中的应用

摘要

【第一部分】无血清培养基保存免和大鼠角膜内皮细胞的活性研究 目的： 本研究旨在通过与含有牛血清的常规MEM和DMEM基础培养基比较，探索两种新型培养基-内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)和无动物细胞成分培养基(animal compound freemedium，ACF)在无血清器官培养保存角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CEC)活性方面的效果。 方法： 选择兔和大鼠角膜片各80只，保存于5种含或不含牛血清的待测培养基(MEM+2％FBS、高糖DMEM+2％FBS、ECM+2％FBS/ECM、ACF)中3周，然后进行内皮细胞活性检测。评价指标包括： ①保存前后角膜内皮细胞密度(endothelial cells density，ECD)及活性染色； ②兔角膜厚度测量； ③免疫组织化学染色法(immunohistochemistry，IHC)检测兔角膜内皮层中肌动蛋白微丝(filament actin，F-actin)和大鼠角膜内皮层中紧密连接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)的表达，衡量内皮细胞间连接的紧密程度； ④免疫印迹法(western blotting，WB)半定量检测兔角膜内皮层中F-actin蛋白的表达； ⑤反转录-聚合酶链反应法(reverse transcription polymerase chain reagction，RT-PCR)检测去上皮大鼠角膜中ZO-1mRNA表达水平； ⑥透射电镜(Transmissionelectron microscopy，TEM)观察保存后兔CEC的超微结构变化。 结论： 在器官培养保存角膜过程中，无血清的ECM和ACF培养基在保持CEC活力方面体现出了比常规含血清的MEM和DMEM培养基更好的保护作用，在无血清器官培养方面极具发展潜力。 【第二部分】羟乙基淀粉在器官培养法保存角膜中的脱水作用 目的： 葡聚糖T500是目前器官培养法中应用的标准脱水剂，但其自身仍有一定的细胞毒性，还容易沉积于内皮面。研究一种新的扩容剂-羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)加入器官培养液后对角膜的脱水作用，对其成为新型角膜脱水剂的可行性进行初步探讨。 方法： 18对配对兔角膜片，一半于无血清ACF培养液中保存21d，再以葡聚糖T500脱水48h作为对照组；另一半于含10％HES130/0.4的ACF培养液中保存21d作为实验组，不再另行脱水程序。保存结束进行角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CEC)活性检测和植片质量评估。主要评价指标： ①保存前后角膜内皮细胞密度(endothelial cells density，ECD)及活性染色； ②角膜厚度测量； ③角膜含水量测定； ④角膜透明度和后弹力层皱褶程度； ⑤免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测兔角膜内皮层中F-actin的表达情况； ⑥免疫印迹法(western blotting，WB)半定量检测兔角膜F-actin蛋白表达程度； ⑦透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)观察保存后兔CEC的超微结构变化。 结论： HES加入器官培养液中可以有效避免角膜过度水肿，而且内皮细胞毒性小，可以成为器官保存液中的持续添加物。HES的应用也简化了角膜处理程序，保存完毕不需要再单独脱水，也在一定程度上减轻了感染风险，有希望成为器官培养保存角膜法中的新型脱水剂。 【第三部分】腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染器官培养法保存免角膜内皮细胞 目的： 器官培养法可以保存角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CEC)活性长达数周，是一种有效的中长期保存方法。但是免疫排斥反应仍是目前导致移植失败的重要原因。预先以目的基因转染供体植片可能会给控制术后排斥反应发生，进而阻止CEC损失带来希望。本研究目的是探索腺病毒载体对器官培养法保存的离体兔角膜片上CEC的转染效率，以报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)的荧光表达检测腺病毒的转染效率和动态过程。 方法： 器官培养保存2～3周的新西兰大白兔去上皮角膜片与编码EGFP的复制缺陷型腺病毒载体Ad5(5×106～5×109vp/uL)37℃下共同孵育，转染后继续31℃器官培养角膜2周。剥离大部分基质后荧光显微镜下观察不同时间点EGFP在植片CEC中的表达强度，比较不同浓度腺病毒载体的转染效率。台盘蓝-茜素红活性计数转染后角膜内皮细胞密度(endothelial cells density，ECD)。 结论： 器官培养法保存的角膜内皮细胞层可以被腺病毒载体高效率、特异性地转染成功并持续表达，转染效率略低于新鲜角膜片。EGFP可以成为监测这一转染过程的理想标记物。 【第四部分】种细胞因子和T细胞亚群在改良器官培养法保存角膜移植术后排斥反应中的作用 目的： 本实验拟通过建立不同类型器官培养法保存角膜植片的大鼠角膜移植模型，检测移植后数种参与两类辅助性T细胞因子Th1/Th2平衡调节作用的细胞因子和T细胞亚群在眼局部和(或)全身的表达，分析其在器官培养保存角膜移植相关免疫排斥反应中的作用。 方法： 选用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，新西兰大白兔12只。将54只SD大鼠按随机数字表法分为5组： ①正常大鼠角膜组6只作为对照； ②新鲜大鼠角膜同种异体穿透性移植(penetrating keratoplasty，PKP)组12只； ③去角膜内皮细胞(cornealendothelial cells，CEC)大鼠同种异体角膜+器官保存异种角膜后弹力层和内皮细胞复合体(DM+CEC)移植组12只； ④器官培养法保存大鼠角膜同种异体PKP组12只。以上各组均制备Wistar→SD大鼠角膜移植模型； ⑤大鼠去CEC同基因角膜+器官保存异种角膜内皮细胞复合体(DM+CEC)移植组12只，制备SD→SD同基因大鼠角膜移植模型。各移植组均保留6只用于观察移植后植片存活时间，观察期30d。异种角膜DM+CEC复合体取材于器官培养法保存2～3周的兔角膜。 术后观测内容： ①裂隙灯观察植片存活时间和排斥情况； ②应用酶联免疫吸附实验(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测房水和血清中白细胞介素2(IL-2)、干扰素-gamma(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量； ③术后第11～15天，应用免疫组织化学方法(immunohistochemistry，IHC)检测植片内CD25+T细胞的表达； ④利用反转录_聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreagction，RT-PCR)检测植片内TNF-αmRNA、IFN-γmRNA、IL-4mRNA、CD25 mRNA的表达； ⑤利用流式细胞术检测外周血中CD25和CD28亚群的表达。 结论： Th1/Th2平衡调节机制和CD28+T细胞亚群在器官培养法保存角膜移植后的免疫排斥反应中发挥了重要作用；动态检测外周血CD28和IFN-γ等Th1因子和Th2因子的表达有助于临床了解局部免疫反应进程并预测角膜移植排斥反应的发生。器官培养法保存的角膜，无论是以全层还是单纯DM+CEC复合体形式进行移植，术后植片的存活时间都得以延长，排斥反应发生延缓，细胞因子表达有从TH1类向TH2类偏离趋势。促进IL-4等Th2因子表达，抑制Th1类因子表达可能有益于降低排斥反应。同基因大鼠去CEC角膜联合器官保存兔异种CEC移植取得了最佳效果，为深层角膜病患者及时有效复明提供了新思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分改良器官培养法保存角膜的内皮细胞活性研究——探索中长期保存内皮细胞活性的最佳途径

引言

一、无血清培养基保存兔和大鼠角膜的内皮细胞活性研究

前言

（一）材料和方法

（二）结果

（三）讨论

参考文献

插图

二、羟乙基淀粉在器官培养法保存角膜中的脱水作用

前言

（一）材料和方法

（二）结果

（三）讨论

参考文献

插图

第二部分腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染器官培养法保存兔角膜内皮细胞的研究

前言

（一）材料和方法

（二）结果

（三）讨论

参考文献

插图

第三部分多种细胞因子和T细胞亚群在改良器官培养法保存角膜移植术后排斥反应中的作用

前言

（一）材料和方法

（二）结果

（三）讨论

参考文献

插图

绿色荧光蛋白特性及其在角膜内皮疾病研究中的应用

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