低强度脉冲式超声波(LIPU)与转化生长因子-β1(TGF-β1)联合应用对体外三维培养兔BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的： 1．构建BMSCs-藻酸盐天然材料三维支架，观察BMSCs在立体培养条件下的生长情况、增殖能力、与平面培养条件下的差异； 2．通过一定浓度梯度的TGF-B1作用于三维培养条件下的BMSCs，观察其生长及增殖情况、软骨细胞分化能力，探索BMSCs三维培养条件下TGF-B1作用的最适浓度； 3．探索LIPU作用于BMSCs-藻酸盐三维培养体系，促软骨细胞分化的最佳强度。 4．探索LIPU与TGF-B1共同作用对BMSCs的增殖、分化影响及促软骨细胞分化能力。 5．探讨LIPU与TGF-B1共同作用对BMSCs的增殖、分化协同作用，及可能的分子生物学机制。 方法： 1．采用梯度离心结合贴壁筛选法分离、纯化兔骨髓间充质干细胞，通过原代及传代培养、扩增，应用免疫组化染色对BMSCs的表型进行鉴定； 2．构建BMSCs-藻酸盐天然支架材料三维培养体系，大体观察，倒置显微镜观察BMSCs的生长情况，增殖能力，绘制细胞生长曲线； 3．对BMSCs-藻酸盐三维培养凝珠在一定作用时间内，施加强度为2 mW/cm2、10mW/cm2、30 mw/cm2的LIPU刺激，通过大体观察、生长曲线绘制、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型、Ⅹ型胶原免疫组化染色，观察不同强度的LIPU刺激对BMSCs的增殖、分化能力的影响； 4．通过浓度梯度为0、5、10、40 ng/ml TGF-B1作用于BMSCs-藻酸盐三维培养凝珠，通过大体观察、生长曲线绘制、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色观察不同浓度的TGF-β1对三维培养条件下BMSCs的增殖、分化能力的影响； 5．通过前两步实验得到的LIPU刺激最适强度及TGF-β1作用最佳浓度，最后将对两种因素共同作用于BMSCs-藻酸盐凝珠，通过大体观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、Realtime-PCR检测与细胞增殖、促软骨细胞分化相关的Coll-Ⅰ、Coll-Ⅱ、Coll-Ⅹ和aggrecan、TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡmRNA的相对表达，观察两者共同作用有无协同作用 结果： 1．通过梯度离心结合贴壁筛选法分离方法获得BMSCs，经鉴定为未分化的BMSCs； 2．BMSCs-藻酸盐培养体系为半透明亲水性凝胶，BMSCs可以保持良好的生物学形态，培养第7-21天细胞增殖明显，较平面培养获得更多的细胞量，为BMSCs提供良好的生长微环境； 3．强度为30mW/cm2的LIPU可以促进BMSCs增殖，强度为10mW/cm2的LIPU可以促进BMSCs表达Ⅱ型胶原，各组Ⅹ型胶原染色均为阴性，说明上述强度的LIPU刺激均未导致BMSCs分化为肥大软骨细胞： 4．浓度为10 ng/ml的TGF-β1可以更好的诱导BMSCs向软骨细胞分化，说明在三维培养条件下TGP-β1作用的最适浓度与多数文章报道的平面培养最适浓度10 ng/ml一致； 5．LIPU10 mw/cm2+TGF-β110ng/ml组Ⅱ型胶原免疫组化染色呈强阳性表达，LIPU10 mw/cm2+TGF-β110ng/ml组aggrecan、Coll-Ⅱ基因的mRNA的表达明显上调，较单独应用一种方法有效，有统计学意义；TGF-β1可以同时上调TGF-β1RⅠ及基因的TGF-β1RⅡ基因mRNA表达，上述两种受体基因的表达与Ⅱ型胶原及aggrecan基因表达则增加存在一定相关性。TGF-β1及LIPU均可以上调aggrecan、CollagenⅡ基因的表达，但LIPU并不能上调TGF-β1RⅠ及TGF-β1RⅡ基因mRNA表达。 结论： 1．采用密度梯度离心结合贴壁筛选法可以有效分离、纯化骨髓间充质干细胞，经过体外单层培养扩增可获得成分单一、未分化的BMSCs。 2．BMSCs-藻酸盐三维培养体系是一种具有良好安全性、可靠性的组织工程支架，较平面培养能够获得更多的种子细胞，减少因平面培养引起的细胞生长抑制现象，为细胞的生长提供了良好的微环境。 3．在一定时间内，强度为30mW/cm2的LIPU可以促进BMSCs增殖，强度为10mW/cm2的LIPU可以促进BMSCs的Ⅱ型胶原表达，各组X型胶原染色均为阴性，说明30mW/cm2以内的LIPU刺激强度并未导致BMSCs分化为肥大软骨细胞。 4．浓度为10 ng/ml的TGF-β1可以更好的诱导BMSCs向软骨细胞分化，说明在三维培养条件下TGF-β1作用的最适浓度与多数文章报道的平面培养最适浓度10 ng/ml一致。 5．TGF-β1可以同时上调TGF-βBRⅠ及基因的TGF-β1RⅡ基因mRNA表达，上述两种受体基因的表达与Ⅱ型胶原及aggrecan基因表达则增加存在一定相关性。TGF-β1及LIPU均可以上调aggrecan、CollagenⅡ基因的表达，但LIPU并不能上调TGF-β1RⅠ及TGF-β1RⅡ基因mRNA表达，其结果符合生长因子是细胞作用信号传导过程中，增加TGF-β1Ⅰ、Ⅱ型受体表达的增加而改善细胞功能、促进细胞分化，而LIPU则是通过细胞的力学刺激信号传导通路改善细胞功能，促进细胞分化的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 新西兰兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、培养扩增及鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、附图

第二部分 构建BMSCs-藻酸盐凝珠三维培养体系

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、附图

第三部分 LIPU对体外三维培养条件下兔BMSCs的生物学效应及作用机制

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、附图

第四部分 转化生长因子-β1(TGF-β1)作用于BMSCs-藻酸盐三维培养体系

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、附图:

第五部分 低强度脉冲式超声波(LIPU)作为一种力学因素和转化生长因子-β1(TGF-β1)联合应用于BMSCs-藻酸盐三维培养体系

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、附图

全文总结

参考文献

文献综述 低强度脉冲超声波(LIPU)的生物学效应及应用

在校期间撰写及发表论文情况

致谢