人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架组织工程心脏瓣膜研究

摘要

目的：通过生物信息学的方法找到人与猪细胞外基质蛋白的基因序列差异，并验证猪基质的免疫原性；通过人的细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建新型的组织工程瓣膜，并验证人细胞外基质包被瓣膜的效果。方法：(1)人与猪基质蛋白差异性生物信息学分析。(2)制备抗猪与人细胞外基质蛋白的单克隆抗体。(3)用制备的单克隆抗体来检测猪去细胞瓣膜的免疫原性。(4)用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜并用抗体来检测细胞外基质的粘附效果。结果：通过基因比对的方法找到了人与猪Ⅳ型胶原的基因序列差异。通过杂交瘤技术成功制备检测细胞外基质的单克隆抗体。成功构建了由人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架的组织工程瓣膜。用免疫组化的方法检测到猪去细胞瓣膜上有猪的细胞外基质存留，在构建的瓣膜表面成功粘附上了人的细胞外基质。结论：猪去细胞瓣膜支架上检测到有猪的细胞外基质存留；体外构建的组织工程瓣膜上检测到有人的细胞外基质粘附。 研究背景和目的： 目前使用的人造心脏瓣膜因为有很多缺点使得它们在临床上的长期使用受到限制：机械瓣膜需要长期抗凝治疗，生物瓣膜容易出现衰败，尤其在年青患者中更是限制了它的应用。在儿童先天性心脏病中，同种心脏瓣膜在右心室流出道的修复中也被应用，但是耐久性差、功能失调和不能随机体共同生长等缺点也限制了同种心脏瓣膜的使用。其它类型的瓣膜替代物与同种心脏瓣膜相比也同样存在各种缺点。组织工程学方法是试图应用一个有抗凝血功能的支架材料与有修复和重建能力的细胞内膜共同组成一个自体的有活力的心脏瓣膜来克服这些缺点。组织工程器官研究包括种子细胞、瓣膜支架材料以及瓣膜组织的形成和再生三大部分。组织工程心脏瓣膜(tissue engineering heart valve，TEHV)的体外构建首先要将种子细胞成功地种植到瓣膜支架上。细胞和支架之间的相互作用，包括细胞在支架上迁移、分化和增殖等生物活动，都是以细胞和支架的粘附为基础。细胞与瓣膜支架材料的相互作用一直是THEV研究的重要领域，其核心是种子细胞在支架材料上的粘附。有一些国内外的研究小组已经报告了通过在异种移植物上种植骨髓基质干细胞来创建自体有活力的瓣膜结构。然而，由于细胞与支架的粘附问题、延迟的再内皮化以及只能部分重建等问题，使得组织工程瓣膜的使用也受到了限制。作为种子细胞生长活动的第一步的细胞粘附问题成为了组织工程心脏瓣膜构建和使用的最主要问题，而且细胞粘附也进一步影响到了瓣膜的再内皮化和组织器官重构等其它功能的实施。 为了解决上述的这些问题，美国的Crylife公司研制了一种脱细胞的猪主动脉瓣膜作为替代物使用。这种瓣膜通过Synergraft技术脱细胞处理，使猪瓣膜应用在主动脉或肺动脉部位的手术中，因此这种去细胞的猪瓣膜又叫做Synergraft瓣膜。发明者认为这种Synergraft瓣膜的抗原性很低，而且还可以有自体的细胞在瓣膜上生长来构建成为一个“活”的器官。在2001年，4个Synergraft瓣膜被植入4名男性儿童患者的右心室流出道部位。手术过程进行顺利。但是在植入瓣膜后的6周和1年以后，2例患儿因为Synergraft瓣膜的严重衰败而死亡，第3例患儿因为植入瓣膜的撕裂而死亡，第4例患儿在植入瓣膜后的第2天又不得不手术取出了所植入的瓣膜。取出的瓣膜从肉眼观，4个瓣膜的瓣叶和血管壁上都有因严重的炎性反应而造成的结构破坏和严重退化。病理学报告在所植入瓣膜的早期和1年左右有因中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞参与的免疫排斥反应。在植入的瓣膜上未发现有宿主的细胞再生生长。而且在未植入人体的Synergraft瓣膜中发现有去细胞不完全和钙盐沉积的情况存在。从这些病例中研究者们得出了这样一个结论：在Synergraft瓣膜上的异体细胞外基质引发了人体一个强烈的炎症反应。异体的胶原基质与血液的接触激活了一系列级联反应，导致了血细胞激活、化学介质和集落刺激因子的释放、多型核中性粒细胞和巨噬细胞的渗入。这些早期的炎症反应严重地削弱了瓣膜内壁的基质结构，导致了移植物的结构破坏及衰败。所以后来Synergraft瓣膜的使用不得不被中止了。 从Synergraft瓣膜的事件中我们也认识到猪去细胞瓣膜仍然具有免疫原性，尤其是在儿童患者中这种免疫反应会更强烈。因此对于细胞外基质蛋白引起的免疫排斥反应仍需要进一步的研究。细胞外基质蛋白包括胶原、层粘连蛋白、粘蛋白和蛋白聚糖等。这些细胞外基质的共同特点是它们的主要分子结构都是大分子蛋白质。 本课题的研究目的是：第一、通过生物信息学的方法找到人与猪细胞外基质蛋白的基因序列差异，并验证其免疫原性。第二、通过人的细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架构建新型的组织工程瓣膜，并验证人细胞外基质包被瓣膜的效果。 方法： 1．人与猪主要细胞外基质蛋白差异性研究。 (1)应用生物信息学的方法找出人与猪细胞外基质蛋白(Ⅳ型胶原为例)的基因序列差异。 (2)采用Blast工具比较人及小鼠的Ⅳ型胶原序列，随后针对Ⅳ型胶原高变区域的两侧保守区域设计引物，PCR扩增猪Ⅳ型胶原的相应片段，测序后与人Ⅳ胶原进行同源比较，获得差异片段。 2．抗猪与人细胞外基质蛋白单克隆抗体的制备。 (1)有差异的基因序列通过工程菌表达蛋白：将有差异的基因序列反转录成cDNA，通过PCR方法扩增包含差异基因序列的基因片段，经DNA测序证实后克隆至原核表达载体pET32，重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达并分析表达结果。 (2)抗猪或人的Ⅳ型胶原抗原单克隆抗体的的制备：以纯化的重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，含阳性血清的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经HAT选择性培养基克隆化培养，用间接ELISA方法重复筛选后，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。将培养上清液浓缩后进行亚类鉴定。 3．用免疫组织化学的方法来检测瓣膜标本的免疫原性。Ⅰ抗是我们在第二阶段实验中制备的抗猪细胞外基质的单克隆抗体。 4．用人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架来构建组织工程瓣膜并检测构建效果。 (1)BMSCs的分离和培养：穿刺抽取健康志愿者骨髓液，Percoll密度梯度离心法获取BMSCs，DMEM培养液体外培养扩增，采用CD34、CD71、CD44和Desmin免疫组化染色及流式细胞仪(FCM)等方法对细胞表型进行分析鉴定。 (2)组织工程心脏瓣叶的体外构建：采用0.025％胰酶8小时+核酸酶+1％DCA持续震荡24小时进行猪主动脉瓣的脱细胞处理，通过组织学切片、电镜检查观察去细胞效果。 (3)用层层静电自组装的方法将壳聚糖/透明质酸共混膜预涂在瓣膜表面以增加生物相容性和粘附力--猪瓣膜支架被交替浸泡在2％壳聚糖乙酸溶液和0.2％透明质酸溶液中10次，然后在30℃环境中干燥。这样就通过静电力的方法在瓣膜支架上形成一层共混膜。 (4)TEHV的体外构建：实验分为2组，分别为静态组和实验组，每组8个瓣叶。均以壳聚糖/透明质酸涂膜后的猪去细胞主动脉瓣为支架。实验组构建第3天转入水平流场内进行冲刷实验，在流场力环境下构建4天。 (5)用免疫组织化学的方法来检测基质粘附效果。Ⅰ抗是我们在第二阶段实验中制备的抗人细胞外基质的单克隆抗体。 结论： 1．人与猪的主要细胞外基质蛋白(Ⅳ型胶原)的基因序列存在差异。 2．应用有差异的基因序列表达的蛋白可以成功制备检测细胞外基质蛋白的单克隆抗体。 3．在猪去细胞瓣膜支架上检测到有细胞外基质存留。 4．在体外成功构建了由人细胞外基质包被猪去细胞瓣膜支架的组织工程瓣膜并检测到有人的细胞外基质粘附。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分人与猪基质蛋白差异性生物信息学分析

第二部分针对人与猪基质蛋白差异片段的单克隆抗体制备

第三部分针对基质蛋白差异片段单抗的特异性检测

第四部分猪瓣支架组织工程心脏瓣膜构建人基质蛋白履盖效果检测

全文总结

综述：组织工程心脏瓣膜中种子细胞粘附机制的研究进展

读博士期间撰写及发表论文情况

致 谢