膝关节ACL损伤及重建后本体感觉的实验研究

摘要

膝关节的本体感觉与其功能密切相关。膝关节前交叉韧带(anterior cruciateligament，ACL)损伤及重建后其本体感觉的改变是不容回避的问题，对此进行深入研究必将对膝关节的治疗产生深远影响。本研究分别制作兔ACL部分损伤动物模型、异种肌腱移植物重建损伤ACL动物模型和LARS人工韧带重建损伤ACL动物模型，分别于术后不同时间点对损伤ACL/移植物进行氯化金染色光学显微镜检查和PGP9.5免疫荧光染色后激光共聚焦电子显微镜检查观察韧带内神经结构形态学变化，用RT-PCR法检测韧带中GAP-43和PGP9.5的mRNA表达情况以评价损伤ACL/移植物内神经成分比例及神经再生情况，通过HRP逆行追踪技术和电生理检查(包括体感诱发电位和胭绳肌肌电图)评价损伤ACL/移植物内神经结构的功能情况。本文包括三部分内容：前交叉韧带部分损伤后内部本体感受器的变化；异种肌腱移植物重建损伤ACL后的神经再生研究；人工韧带重建损伤ACL后的神经再生研究。 研究背景和意义： 膝关节的本体感觉是关于膝关节运动和位置的感觉信息，可以提供有关膝关节运动及位置的信息，对于肌肉控制是非常重要的，是维持膝关节动态稳定的重要因素。作为支持膝关节稳定性的主要结构，前交叉韧带(ACL)中的传入纤维是膝关节周围神经控制环路中的重要组成部分，在正常步态膝关节的持续神经感受控制中发挥重要作用。当ACL损伤时，膝关节不仅失去一个强大的稳定结构，而且也导致膝关节本体感觉严重损害。多项研究表明，ACL损伤治疗后，标准膝关节评分和临床韧带强度试验与患者满意度和功能结果关系不大，而ACL本体感觉与后二者关系密切。最近的研究更明确地指出患者满意度和ACL本体感觉关系最密切，其次为本体感觉和Lysholm评分，而患者满意度和Lysholm评分之间的相关性较差，关系最不密切的是本体感觉与韧带松弛程度以及患者满意度与韧带松弛程度。 对于ACL部分损伤患者，临床研究证实康复治疗不但有助于提高膝关节的稳定性，而且可明显改善本体感觉状态。目前认为这与本体感觉代偿机制有关。但对于ACL不完全损伤患者，残存的ACL仍然连接股骨髁和胫骨平台，其内保留的本体感受器是否仍可以发挥作用，以及这些本体感受器随时间延长而发生的变化，目前研究报导少见。对于ACL损伤严重者，关节镜下自体肌腱移植物重建ACL术证实不但可以改善膝关节的稳定性，而且可以促进膝关节本体感觉的恢复。但随着关于自体移植物取材部位并发症报导的不断出现，而且也有研究证实髌腱的取材降低了股四头肌的肌力、胭绳肌的取材可以明显降低髋关节内收肌力和膝关节屈曲肌力，这对膝关节的稳定都会产生不利影响，异体/异种移植物和人工韧带的研究的得到了广泛的关注。但是目前关于应用异体/异种移植物或人工韧带移植物重建ACL临床效果的研究主要集中在使膝关节恢复力学稳定性和可能出现的并发症上，而针对术后本体感觉恢复状况的研究少见。 相对于ACL的力学研究，有关ACL本体感觉的研究时间还很短。不论是其形成机制，还是损伤及重建后的康复形式，都有待于进一步的研究和探讨。ACL损伤后，本体感觉的改变是不容回避的问题，在这个领域的深入研究必将对ACL、甚至膝关节损伤的治疗观念产生深远的影响。本研究采用形态学、分子生物学和电生理学方法，对不同时间段ACL部分损伤后残存韧带内的本体感受器的形态和功能的变化、以及应用异种移植物和人工韧带移植物重建ACL术后移植物内是否有再生的本体感受器及其形态和功能的变化进行观察，希望能为ACL损伤的治疗作出应有的贡献。 第一部分前交叉韧带部分损伤后内部本体感受器的变化 研究目的：观察ACL部分损伤后不同时间段残存韧带内的本体感受器的形态和功能的变化。 研究方法：制造兔膝关节ACL部分损伤模型，分别于术后2、4、6个月对ACL组织进行氯化金染色光学显微镜检查和PGP9.5免疫荧光染色后激光共聚焦电子显微镜检查观察韧带内神经结构形态学变化，用RT-PCR法检测韧带中GAP-43和PGP9.5的mRNA表达情况以评价损伤韧带组织随时间变化神经成分比例及神经再生情况，通过HRP逆行追踪技术和电生理检查(包括体感诱发电位和胭绳肌肌电图)评价损伤韧带内神经结构的功能情况。 结果：ACL损伤后韧带内本体感受器的数量逐渐减少，本体感受器的形态发生改变，异形的本体感受器增多，体积缩小，部分结构缺失，HRP逆行追踪染色显示神经节阳性区域逐渐缩小，PGP9.5 mRNA的表达逐渐减弱，也说明韧带内神经纤维数量有随时间延长减少趋势。同时，ACL损伤后出现低强度的GAP-43mRNA的表达(主要是术后2个月)，说明韧带内的神经纤维可能存在短暂的再生修复现象。电生理学检查刺激损伤的ACL得到的SEPs和胭绳肌EMG的潜伏期、波幅随时间延长逐渐降低。 结论：ACL损伤后，韧带内的本体感受器短期内仍能发挥一定的作用，但是随着时间的延长，其作用逐渐减弱。 第二部分异种肌腱移植物重建损伤ACL后的神经再生研究 研究目的：检测ACL损伤异种移植物重建术后不同时间段移植物内是否有再生的本体感受器或神经成分以及新生本体感受器的功能。 研究方法：选取犬胭绳肌腱修剪并去除免疫源性后制备成异种移植物重建兔ACL，分别于术后3、6、9、12个月对移植物进行氯化金染色光学显微镜检查和PGP9.5免疫荧光染色后激光共聚焦电子显微镜检查观察移植物内是否有神经结构再生及其形态学变化，用RT-PCR法检测移植物中GAP-43和PGP9.5的mRNA表达情况以评价损伤移植物内随时间变化神经再生情况，通过HRP逆行追踪技术和电生理检查(包括体感诱发电位和胭绳肌肌电图)评价移植物内新生神经结构的功能情况。 结果：采用异种肌腱移植物重建兔ACL术后，移植物内有神经纤维再生，并可观察到不典型的本体感受器结构，术后9个月电刺激移植物可以出现SEPs和胭绳肌EMG，虽然检测到的SEPs和EMG的潜伏期和波幅小于正常者，但也说明新生的神经末梢结构是有功能的。直到术后1年，这些新生的本体感受器不论是形态、数量还是功能都与正常ACL差异显著，但此时的RT-PCR检查发现GAP-43 mRNA的表达呈中等程度的阳性，说明移植物内仍然存在着神经纤维再生活动。 结论：采用异种移植物重建ACL术后1年，移植物内出现了具有一定形态和功能的类本体感受器结构，但与正常差别仍然较大，需延长观察时间以进一步研究移植物内神经纤维再生情况。 第三部分人工韧带重建损伤ACL后的神经再生研究 研究目的：检测ACL损伤LARS人工韧带重建术后不同时间段移植物内是否有再生的本体感受器或神经成分以及新生本体感受器的功能。 研究方法：按照成品EARS人工韧带的结构特点制作应用于兔的LARS人工韧带移植物重建损伤的兔ACL，分别于术后3、6、9、12个月对移植物进行氯化金染色光学显微镜检查和PGP9.5免疫荧光染色后激光共聚焦电子显微镜检查观察移植物内是否有神经结构再生及其形态学变化，用RT-PCR法检测移植物中GAP-43和PGP9.5的mRNA表达情况以评价损伤移植物内随时间变化神经再生情况，通过HRP逆行追踪技术和电生理检查(包括体感诱发电位和胭绳肌肌电图)评价移植物内新生神经结构的功能情况。 结果：采用LARS人工韧带重建兔ACL术后6个月观察到韧带内有少量新生的神经纤维，术后9个月时可观察到不典型的本体感受器样结构，电刺激移植物时术后9个月可以诱导出SEPs，术后12个月时所有检查动物都出现SEPs和胭绳肌EMG，但新生的本体感受器形态不典型、数量少、功能显著低于正常ACL内本体感受器。RT-PCR检查显示术后6个月起GAP-43基因低等程度阳性表达，持续到术后1年，说明韧带移植物内1年后仍然可能存在神经再生现象。 结论：采用LARS人工韧带重建ACL，移植物内可以出现神经再生现象，部分新生的神经纤维形态上类似本体感受器，并且具有一定的本体感觉功能，但与正常差别仍然较大，需延长观察时间以进一步研究移植物内新生神经纤维形态和功能情况。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

绪言

第一部分前交叉韧带部分损伤后内部本体感受器的变化

一前言

二材料和方法

1 试剂和设备

2 实验动物分组与动物模型制备

3 术后对韧带内神经结构的形态学检查

4 辣根过氧化物(horseradish peroxidase,HRP)逆行追踪技术

5 RT-PCR检测

6 电生理学检查

三结果

1 术后对韧带内神经结构的形态学检查

2 HRP逆行追踪技术

3 RT-PCR检测

4 电生理学检查

四讨论

参考文献

第二部分异种肌腱移植物重建损伤前交叉韧带后的神经再生研究

一前言

二材料和方法

1 试剂和设备

2 异种肌腱移植物的制备及检测

3 实验动物分组与动物模型制备

4 术后对异种肌腱移植物内神经结构的形态学检查

5 RT-PCR检测

6 电生理学检查

三结果

1 异种肌腱移植物的检测

2 术后对异种肌腱移植物内神经结构的形态学检查

3 HRP逆行追踪技术

4 RT-PCR检测

5 电生理学检查

四讨论

参考文献

第三部分人工韧带重建损伤前交叉韧带后的神经再生研究

一前言

二材料和方法

1 试剂和设备

2 人工韧带移植物的制备及检测

3 实验动物分组与动物模型制备

4 术后对LARS韧带内神经结构的形态学检查

5 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)HRP逆行追踪技术

6 RT-PCR检测

7 电生理学检查

三结果

1 LARS韧带移植物的生物力学检测

2 术后对LARS 韧带移植物内神经结构的形态学检查

3 HRP逆行追踪技术

4 RT-PCR检测

5 电生理学检查

四讨论

参考文献

全文小结

本课题的创新点和意义

文献综述一 交叉韧带—膝周肌群反射的存在与特点

文献综述二 韧带—骨交界处组织理化特性及相关组织工程学策略

在读期间发表论文

致谢

检索证明