携蜂毒素基因重组增殖型腺病毒的构建及特异性抑制肝癌细胞增殖作用研究

摘要

研究目的：构建以HREAFP杂合启动子调控Ela区，Elb区缺失55KDa蛋白，并由晚期启动子MLP调控Melittin基因的重组增殖型腺病毒。观察其特异性地在肝癌细胞中的增殖情况及特异性地抑制肝癌细胞增殖的作用。 研究方法：将携带Melittin基因的质粒pENTR-MLP-Melittin与腺病毒骨架质粒pPE3-F11B通过LR重组，构建质粒pPE3-F11B-MLP-Melittin。将其与含有杂合启动子HREAFP的质粒PXC20-ΔElb-55kda-HREAFP共同转染人胚肾293细胞，得到由HREAFP调控Ela区，Elb区缺失55kda蛋白的携Melittin基因的重组增殖型腺病毒OG511-HA-Melittin。PCR技术鉴定正确后，大量扩增病毒，氯化铯密度梯度离心法纯化，并用TCID50法并测定病毒滴度。病毒增殖实验观察该病毒在甲胎蛋白阳性肝癌细胞、甲胎蛋白阴性肝癌细胞及正常肝脏细胞感染、复制增殖情况。MTT实验观察该重组腺病毒对甲胎蛋白阳性肝癌细胞、甲胎蛋白阴性肝癌细胞及正常肝脏细胞的增殖抑制效果。 结果：成功构建携蜂毒素基因的重组增殖型腺病毒，PCR鉴定该病毒可以扩增出与HRE，AFP，ΔElb-55kda，MLP-Melittin相对应的目的条带，分别为166bp，276bp，1832bp，534bp。病毒在293细胞中扩增后纯化，用TCID50法测得该病毒的滴度达到1.58×109fu/ml。增殖实验表明，病毒QG511-HA-Melittin在甲胎蛋白阳性Hep3B肝癌细胞48h的增殖倍数高达12800倍，在甲胎蛋白阴性肝癌细胞SSMC-7721中48h的增殖倍数130倍，在人正常肝细胞L0248h的增殖倍数19.68倍。MTT实验表明QG511-HA-Melittin对甲胎蛋白阳性的肝癌细胞株Hep3B有明显的杀伤作用，在MOI=5时即可杀伤半数的Hep3B细胞，与SMMC-7721和L02相比具有显著差异(p＜0.05)。 结论：成功构建了携蜂毒素基因的重组增殖型腺病毒，将蜂毒素基因作为目的基因插入到重组增殖型腺病毒中，并由MLP启动子调控。该重组增殖型腺病毒能特异性在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中增殖，而对甲胎蛋白阴性肝癌细胞及正常肝脏细胞则影响不大，并且能特异性地抑制甲胎蛋白阳性的肝癌细胞增殖。该方案充分发挥了病毒基因治疗的优势，为肝癌等实体肿瘤的治疗提供了一种新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分携蜂毒素基因增殖型腺病QG511-HA-Melittin的构建

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

讨论

参考文献

第二部分携蜂毒素基因增殖型腺病毒QG511-HA-Melittin对人肝癌细胞增殖抑制作用研究

全文小结

附录

文献综述 蜂毒素的研究现状

在读期间参与的项目

致谢