结直肠癌复发转移临床特征及血清蛋白质指纹谱在原发瘤围术期的应用

摘要

研究背景与目的： 结直肠癌包括结肠癌与直肠癌，是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。在我国，随着人民生活水平的提高和生活方式的改变，结直肠癌的发病率逐年上升。近年来尽管在诊断、治疗方面有了长足的进展，但结直肠癌的总体疗效并无明显改善，手术后5年生存率仍徘徊在50％左右。而早期结直肠癌患者预后较好，5年生存率达到90％～100％。但早期患者常无自觉症状，常规体检不易发现异常，大约1/3的患者出现症状并被明确诊断时已存在局部进展或转移，相对生存率不到40％。加上结直肠癌根治术后有超过20％的患者出现复发转移，也严重影响着患者的生存率。由于原发部位的不同，结肠癌与直肠癌在肿瘤的生物学行为上不完全一致，在术后的复发转移及预后方面也存在着一定的差异，但对此进行相互比较的研究不多，结果不一。 目前，临床上在结直肠癌的早期诊断、预后估计、根治术后的复发转移监测等方面均不同程度地存在着困难。结直肠癌早期诊断和筛检的方法较多，但敏感性与特异性之间的矛盾使得这些方法对该病的早期诊断效果均不理想。在预后估计方面，无论是Dukes分期法还是TNM分期法都存在较大的缺陷。实践中发现，即使是无淋巴结转移的Dukes’B期患者，根治术后也有近30％的患者在5年内死于复发或远处转移。在结直肠癌根治术后的复发转移监测上，约70％的复发转移发生在术后2年内，但通过症状、常规体检发现肿瘤复发转移时已失去了最佳治疗时机，而临床常用的影像学、相关癌基因或肿瘤标记物检测同样存在假阳性及假阴性率高的问题。 研究表明，结直肠癌是在环境和遗传因素共同作用下，通过多基因、多步骤、多阶段的复杂的生物学演变而形成的疾病，在这一分子事件过程中包括了抑癌基因功能的丧失、癌基因的活化等。因此，用单个或数个因子检测对结直肠癌的早期诊断、预后估计以及随访过程中复发转移的监测不可避免地存在敏感性和特异性的矛盾。蛋白质是基因表达的产物，而肿瘤性疾病从蛋白质的角度看，是一种蛋白质缺陷病，其发生过程中有多种蛋白质会发生异常变化。这种变化不仅包括蛋白表达量的增加或减少，还包括蛋白翻译后的不同修饰，从而导致肿瘤组织或体液中相应蛋白质表达谱的改变。为了深入研究恶性肿瘤的发生发展过程，客观上需要在蛋白质组的水平进行进一步探索。蛋白质组学正是以蛋白质组为研究对象，能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，提供一组蛋白质的功能及模式信息，反映细胞内部的遗传特性和外界因素影响的结果。近年发展起来的表面增强激光解吸/离子化-飞行时间-质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry．SELDI-TOF-MS)技术是一种新的蛋白质组学研究方法。由于SELDI-TOF-MS技术的高灵敏度及高通量特性，能反映被检测样本中蛋白质的全貌，进而能同时找到多个蛋白质标志物，客观上为肿瘤的早期诊断、预后估计、复发转移的早期检测提供了可能。 本研究的目的：首先，通过结肠癌与直肠癌根治术后复发转移患者临床病理特征的比较，探讨两者在肿瘤生物学行为上的差异，寻找到对复发转移患者生存时间最具影响力的临床病理因素，以期为临床治疗方案的选择提供更多的理论依据；其次，利用SELDI-TOF-MS技术从结直肠癌与其他恶性肿瘤患者血清中筛选出差异表达蛋白，建立结直肠癌与其他恶性肿瘤的鉴别诊断模型；第三，通过对结直肠癌根治术后复发转移与无瘤生存患者术前、术后血清差异蛋白比较，筛选出与复发转移相关的特异性蛋白标志物，探讨其对结直肠癌根治术后复发转移监测的潜在应用价值。 方法： 1、对结直肠癌根治术后复发转移的病人自发现之日起进行随访，筛选出132例首次住院手术病历与复发转移后随访资料完整者，对其临床病理特征进行回顾性分析。 2、以325例血清标本为研究对象，其中包括结直肠癌68例、其他恶性肿瘤150例(乳腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、肺癌及。肾癌各25例)、结直肠良性病40例及正常人67例。应用SELDI-TOF-MS质谱仪分别测定各组血清标本的蛋白质指纹谱，分别用Biomarker Wizard和Biomarker Patterns软件对指纹谱数据进行分析处理，筛选差异蛋白，建立鉴别诊断决策分类树模型。 3、对至少经过2年随访，明确结直肠癌复发转移者的患者术前、术后血清标本141例，无瘤生存者术前、术后血清标本109例，以及结直肠良性病血清标本44例，正常人血清标本52例进行血清蛋白质指纹谱对比分析，筛选与复发转移特异相关的标志蛋白，探讨其对结直肠癌根治术后复发转移的监测价值。 4、统计学处理。利用SPSS13.0统计软件。计数资料的比较采用列联表X2检验，计量资料的比较采用Students’t检验或方差分析。生存率的估计采用寿命表法，中位生存时间的估计与生存时间的比较采用Kaplan-Meier。法和Log-rank检验。多因素对生存时间的影响用Cox回归模型分析。应用受试者工作特征(receiver operatingcharacteristic，ROC)曲线对诊断试验进行评价。P＜0.05认为差异有统计学意义。 结果： 1、结直肠癌根治术后出现复发转移的患者原发肿瘤以直肠癌居多，占72.7％(96/132)，尤其是中低位直肠癌，占复发转移患者总数的53.0％(70/132)。结肠癌复发转移者与直肠癌复发转移者在原发肿瘤的大体类型、淋巴结转移、肿瘤组织学类型、细胞分化程度、复发转移部位的数目等方面存在着差异。直肠癌复发转移者的生存率优于结肠癌复发转移者，单发转移者生存率优于多发转移者。Cox回归模型多因素分析表明，复发转移后的治疗方式、复发转移部位的数目、原发肿瘤的侵袭深度、淋巴结转移等与患者的生存时间相关。其中，复发转移后的治疗方式是最重要的影响因素。手术治疗优于非手术治疗，根治性手术优于姑息性手术。 2、IMAC30蛋白质芯片具有很高的灵敏性和可靠的重复性，检测同一蛋白峰位置的批内和批间变异系数分别为0.3％和0.5％，检测蛋白峰强度的批内和批间变异系数分别为9％和14％。 3、利用血清蛋白质指纹谱成功建立了用于鉴别结直肠癌与其他恶性肿瘤的最优决策分类树模型，该模型在测试模式下识别结直肠癌与其他恶性肿瘤的准确率分别为86.2％、80.05，0，盲法验证总准确率为74.4％。ROC曲线分析表明，M/Z分别为8911、8919、8964、11726、14049、14139等6种蛋白在结直肠癌与其他恶性肿瘤患者的血清中显著差异表达。 4、结直肠癌根治术后复发转移组与无瘤生存组术前血清比较，有13种蛋白高表达，其中AUC＞0.7且95％可信区间的下限＞0.5的蛋白共有9种，M/Z分别为4527、7501、7763、7799、8739、9099、9314、15620、15821。无瘤生存组患者术后3个月以上时，血清中的蛋白与正常人之间无显著差异，而复发转移者血清中M/Z7763的蛋白仍呈显著高表达，该蛋白在复发转移组患者各时间段的血清中经短暂下降后即呈现出不断升高的趋势。以M/Z7763这一蛋白预测结直肠癌根治术后复发转移的灵敏度为92.09，0，特异度为83.9％，Youden指数0.759，而CEA灵敏度为52.0％，特异度为82.3％，Youden指数0.343。 结论： 1、结肠癌与直肠癌在肿瘤生物学行为上存在着一定的差异，根治术后复发转移者以直肠癌居多，尤其是中低位直肠癌。但直肠癌术后复发转移者的预后优于结肠癌复发转移者。从总体上考虑，复发转移后应争取再次手术治疗，尤其是根治性手术，有助于延长患者生存时间，提高生存质量。 2、建立的血清蛋白质指纹谱实验方法稳定可靠，具有很好的重复性，并适用于其他肿瘤血清蛋白质指纹谱的检测。 3、建立的血清蛋白质指纹谱鉴别诊断模型能有效的对结直肠癌与其他恶性肿瘤加以区分，具有较高的灵敏性与特异性。 4、结直肠癌与其他恶性肿瘤患者血清中存在着M/Z为8911、8919、8964、11726、14049、14139等6种明显差异表达的低分子蛋白。 5、结直肠癌根治术后复发转移的患者在根治术前的血清中即存在着提示预后不良的标志性差异蛋白M/Z7763的高表达。 6、利用M/Z7763蛋白诊断复发转移具有较高的灵敏度和特异度，优于目前常用的血清CEA检测，有望用于结直肠癌根治术后复发转移的监测。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 前言

第二章 主要仪器设备、试剂配制及分析软件

第三章 结直肠癌根治术后复发转移临床病理特征比较与预后分析

一、临床资料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第四章 利用血清蛋白质指纹谱鉴别结直肠癌与其他恶性肿瘤的研究

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第五章 血清蛋白质指纹谱对结直肠癌根治术后复发转移的诊断价值

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

全文小结

文献综述一临床蛋白质组学研究进展

文献综述二应用血清蛋白质指纹谱诊断结直肠癌研究进展

在读期间发表论文

致 谢