红树林植物海芒果来源的抗肿瘤活性物质的筛选及其作用机制研究

摘要

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第三位，仅次于胃癌和食管癌。由于肝癌的易转移性，虽然临床上采取了手术、非手术方式的药物治疗及手术与药物治疗相结合的疗法，但治疗效果始终不能令人满意。手术切除是目前治疗肝癌的重要方法，但手术切除率低及术后易复发等因素严重影响着治疗效果。而临床上普遍应用的化疗药物选择性及敏感性均较差，因而从天然活性物质中寻找并开发有效低毒的肝癌治疗药物变得非常迫切。海芒果的果实有剧毒，以核仁最毒，从中提取的化学成分-强心苷目前已作为主要的抗心衰药物而广泛应用于临床，而对海芒果中抗肿瘤活性成分的研究甚少。 本课题的目的就是：从红树林植物海芒果(Cerbera manghas L．)来源的化合物中筛选抗肿瘤活性物质并进一步研究其可能的作用机理。 方法：利用MTT法研究从海芒果中提取的化合物对人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞张氏肝(Chang Liver)增殖的影响；采用流式细胞仪Propidium Iodide(PI)单标法检测化合物对HepG2细胞周期进程的影响；利用Annexin V-FITC和PI双染后流式细胞仪分析，及DNA片断化分析法(DNA fragment assay)进一步证实化合物是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用；利用荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)观察化合物作用细胞后，对凋亡相关基因表达的影响；利用Caspase检测试剂盒检测化合物作用细胞后对细胞Caspase-3，-8，-9酶活力的影响；采用流式细胞仪异硫氰酸荧光素(FITC)标记的anti-human Fas抗体和藻红蛋白(PE)标记的anti-human FasL抗体检测细胞内Fas和FasL的蛋白表达水平。 结果表明，海芒果果实提取的化合物GHSC-71-GHSC-102对HepG2细胞有不同程度的抑制作用，其中HepG2细胞对化合物GHSC-71最敏感，化合物GHSC-71在25μg/ml的浓度下对HepG2细胞的抑制率达到了98％；进一步在化合物GHSC-71对HepG2细胞增殖影响的研究中发现，GHSC-71对HepG2细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性，在作用HepG2细胞12h，24h，48h和72h后，IC50分别为：2.34±0.08，0.13±10.01，0.15±0.01，0.06±0.01μg/ml，但对人正常肝细胞Chang Liver显示出较低的毒性。流式细胞分析显示，化合物GHSC-71作用HepG2细胞后，HepG2细胞的细胞周期被阻滞在S期和G2/M期，具有时间依赖性。流式细胞仪Annexin V/PI双标检测凋亡率的结果也显示随着药物作用时间的延长，早期凋亡细胞占总细胞数的比例也不断增加，凋亡作用明显。DNA片断化分析结果显示，与对照相比，GHSC-71处理组作用HepG2细胞48h后出现明显的梯形条带，充分证实化合物GHSC-71具有诱导HepG2细胞凋亡的作用。Real-timeRT-PCR结果表明，化合物GHSC-71作用HepG2细胞后24小时后Caspase-3，-8，-9和fas凋亡相关基因mRNA表达水平均有明显升高。在Caspase-3，-8，-9酶活力检测中，当0.1μg/ml GHSC-71处理HepG2细胞后Caspase-3的活性升高比较明显，在处理3h，6h，12h和24h后Caspase-3酶活性分别为对照组的3.33倍(P＜0.05)，5.26倍(P＜0.05)，12.25倍(P＜0.01)，23.84倍(P＜0.01)。Caspase-8，Caspase-9酶的活性在0.1μg/ml GHSC-71处理1h后就开始升高，分别为对照的1.6倍(P＜0.01)和1.45倍(P＜0.05)。虽然Caspase-8，Caspase-9酶的活性随着处理时间的增加有所波动，但与对照相比，Caspase-8，Caspase-9酶的活性总体都呈上升趋势。实验中我们又发现GHSC-71处理后，能使外源性死亡受体Fas及其配体FasL的蛋白水平相应增加。 结论：本课题中，我们发现从红树林植物海芒果果实中提取的一系列皂苷类化合物(GHSC-71-GHSC-102)对肝癌细胞HepG2有不同程度的抑制作用，其中GHSC-71对HepG2细胞的抑制作用最强。GHSC-71可选择性的抑制人肝癌HepG2细胞增殖，但不影响人正常肝细胞Chang liver的增殖。GHSC-71通过使HepG2细胞周期S期和G2/M期阻滞和诱导HepG2细胞凋亡抑制细胞增殖，凋亡过程属于Caspase依赖的凋亡途径，并与死亡受体Fas信号通路有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一章海芒果提取物的分离及抗肿瘤活性物质的筛选

第二章GHSC-71对肝癌细胞HepG2增殖作用的影响

结论

综述 海洋生物肿瘤活性物质的研究进展

致谢

附录 硕士期间论文待发表情况