胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究

摘要

胃癌为最常见的恶性肿瘤之一。由于早期胃癌的发现率低，目前收治的胃癌多数为进展期胃癌，而单纯性手术治疗常难以根治，化疗在综合治疗中发挥了重要作用，因此成为治疗胃癌的主要方法之一。但鉴于多药耐药(multi drug resistance，MDR)对胃癌化疗的影响，相当一部分病例化疗效果不理想。故研究胃癌的多药耐药产生机制对提高胃癌的化疗效果、延长病人的生存期有着重要的意义。 多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药。其中经典的分子机制涉及7号染色体上的mdr1基因过度表达，由它编码的一分子量为170kd的跨膜糖蛋白(P-gp)，能起到能量依赖性药物外排出泵功能。P-gp是由1280个氨基酸残基构成的跨膜蛋白，通过激活ATP泵，阻碍药物向胞内被动扩散，并可将胞内细胞毒药物向膜外主动转动，从而产生多药耐药的作用。许多研究表明，mdr1/P-gp与病人的化疗效果密切相关，mdr1阳性病人生存期短、缓解率低、复发率高。因此，mdr1/P-gp的检测可作为癌症治疗结果的预测指标，也可为临床医生制定化疗方案提供参考依据。 研究表明，P-gp的表达是通过转录及转录后水平调控及各种体内外刺激而引起的应激反应，而转录因子AP-1可以介导P-gp的表达。同时，AP-1通路的调控非常复杂，文献报道，一些信号通路可以激活AP-1的表达。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)系统作为调控细胞信号的主要途径之一，可以调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、黏附、迁移等一系列过程。研究者在一些多药耐药系的细胞中发现，MAPK通路可以影响P-gp蛋白对药物的转运，用特异性的抑制剂阻断这些通路后发现P-gp的表达明显减少。p38信号途径是MAPK家族中的重要组成部分，经外界应激刺激而激活，故又称为MAPK应激信号通路，其在全身炎性反应、细胞凋亡、休克、肿瘤转移、耐药等方面具有十分重要的作用。因此，本课题以p38-MAPK途径为切入点，重点研究其在胃癌多药耐药产生过程中的影响，并进一步揭示胃癌的MDR产生机制，探索肿瘤细胞多药耐药的机理，将对肿瘤临床化疗方案的制定及耐药的逆转具有重要的指导意义。 本实验主要由以下两部分组成： 第一部分多药耐药基因在胃癌耐药细胞中的表达 为明确两种细胞系对化疗药物的耐药性，分别采用不同化疗药物(5-氟尿嘧啶、表柔比星、顺铂)作用于胃癌细胞SGC7901与长春新碱耐药系SGC7901/VCR细胞中，用MTT法检测细胞活性，发现SGC7901/VCR细胞的生存率明显高于SGC7901，提示SGC7901/VCR可能属于多重耐药细胞；随后为检测SGC7901/VCR是否属于特异的多重耐药细胞株，我们分别采用Western blot和RT-PCR方法在两种细胞株中检测多药耐药基因的表达情况。结果提示无论在蛋白水平还是mRNA水平SGC7901/VCR中mdr1基因的表达明显高于SGC7901，从而进一步提示了SGC7901/VCR的多药耐药特性。 第二部分胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究 研究报导，在人类的MDR1启动子区域包含转录因子AP-1的结合位点，表明AP-1可以间接参与调节P-gp的表达；AP-1的活化又可以抵制许多药物抗肿瘤的活性。因此我们首先采用萤光素酶报告基因系统来检测和比较两种细胞中AP-1的活性。实验结果提示在SGC7901/VCR中AP-1活性明显高于SGC7901；而AP-1作为MAPK通路的下游靶基因，在一些耐药细胞中可以明显改变MAPK的表达水平，因此我们利用Western Blot和流式细胞仪检测和比较两种细胞中MAPK途径的表达情况，结果我们发现在SGC7901/VCR细胞中p38-MAPK的活性明显高于SGC7901；为进一步明确SGC7901/VCR细胞的这种特性，我们利用DN-p38和p38的特异抑制剂SB202190来抑制p38的表达后检测ALP-1的活性，在SGC7901/VCR细胞发现与对照相比AP-1的活性表达明显受到了抑制；从而说明p38-MAPK/AP-1途径在SGC7901/VCR细胞中被激活了，并可能与肿瘤细胞的多药耐药的产生机制密切相关。同时，用2μg/ml浓度的顺铂连续24小时作用于SGC7901后用流式细胞仪同样检测到了p38的活性；从而进一步提示p38-MAPK途径与化疗耐药相关。 为进一步验证p38-MAPK途径是否与化疗耐药相关，我们使用p38的特异性抑制剂作用于SGC7901/VCR细胞后检测mdr1的表达及P-gp的功能。实验结果表明，无论在蛋白水平还是mRNA水平都可以看到在使用抑制剂后多药耐药基因mdr1的表达都有明显的下调：同时为检测SB202190对P-gp功能的影响，使用流式细胞仪分析Rh123在细胞内的积聚和贮留现象，结果提示在SGC7901/VCR细胞中使用抑制剂后Rh123在细胞内的积聚和贮留有明显的增加；本实验提示抑制p38途径可以降低mdr1的表达及P-gp的功能。接下来我们分别使用5-氟尿嘧啶、表柔比星、顺铂作用于被抑制了p38-MAPK途径的SGC7901/VCR细胞中，观察细胞形态及分析细胞的调亡的情况，结果表明抑制了p38-MAPK途径后可以提高胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性。 综上所述，本课题得出如下结论： 1、在胃癌耐药细胞中多药耐药的产生与p38-MAPK途径的激活密切相关，而与JNKs和ERKs无明显关系； 2、抑制p38-MAPK途径后可以提高肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分多药耐药基因在胃癌耐药细胞中的表达

一、材料

二、方法

三、结果

讨 论

参考文献

第二部分 胃癌耐药细胞中多药耐药基因上调的分子机制研究

一、材料

二、方法

三、结果

讨 论

参考文献

小 结

附 录

综述一：胃癌多药耐药的研究进展

综述二：TNF-α在肿瘤发生发展中作用的双面性

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