肝细胞核因子4α预防大鼠肝癌及其分子机制研究

摘要

[研究背景及目的] 原发性肝癌是世界第五大常见肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中为第三位。原发性肝癌患者中有85％到90％为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。虽然，在过去的几十年中肝癌的诊断及治疗已经取得了很大的进步和突破，但由于慢性肝炎及肝硬化病人是肝癌的高危人群，所以肝癌的预防仍是全球关注热点。 肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor4，HNF4)是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子，在分化成熟的肝细胞中高表达，其中HNF4α是HNF4的重要亚型。HNF4α参与维护肝细胞脂肪代谢、白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成等重要功能，也是调控上皮细胞表型表达的重要基因。近年的研究提示，HNF4α对上皮细胞间质转型(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)有重要的调控作用。本课题组前期研究发现，HNF4α可以促进肝癌细胞向肝细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖和体内肿瘤生长。 EMT主要是指上皮细胞在细胞形态、细胞结构、细胞功能以及细胞粘附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。近年来研究发现，EMT不仅在肿瘤浸润转移过程中的起重要作用，而且肿瘤细胞发生EMT后成瘤性明显增强并获得了干细胞特性，提示EMT与肿瘤的发生有关。 Wnt/β-catenin信号通路在众多组织中是调控细胞增殖、分化和迁移的重要通路，在肝脏的各种生物学功能中同样发挥着重要作用。β-catenin既是细胞连接的重要组成部分，又是经典Wnt信号通路的关键信号分子。在肝脏纤维化及肝癌发生过程中，伴随着EMT现象的出现，普遍存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，即β-catenin在细胞浆的聚集和/或核转位。另外，在肝前体细胞及肝癌干细胞活化的过程中Wnt/β-catenin信号通路也起着重要的作用。 本课题将系统研究HNF4α对实验性肝癌发生的预防作用，深入探讨其生物学作用的分子机制，为应用HNF4α防治肝癌的临床研究奠定实验基础。 [实验方法] 一、HNF4α预防实验性大鼠肝癌 1．利用AdEasyTM系统构建表达HNF4α的重组腺病毒-AdHNF4α，293细胞包装并反复感染，扩增高效表达HNF4α的AdHNF4α和空白对照病毒AdGFP，浓缩纯化、测定滴度后保存。 2．AdHNF4α抑制DEN诱导大鼠肝癌形成 雄性Wistar大鼠50只，正常对照组12只，其余DEN诱癌组共38只。第1组为正常对照组；第2～4组予DEN溶液按70 mg/kg剂量腹腔注射，每周注射1次，连续注射10 W，制备DEN诱导的大鼠肝癌模型。其中第2组设为模型对照组；第3组为空白病毒AdGFP对照组；第4组设为AdHNF4α导入组。于DEN注射第10 w经尾静脉分别注入5×109pfu AdGFP和5×109pfu AdHNF4α，之后分别于第12 w、14 w、16 w、18 w及20 w经尾静脉给予注射相同滴度的病毒，并在10 w、11 w、15 w及18 w每组随机处死2只大鼠，在22 w处死剩余大鼠。分别观察各组大鼠肝脏大体变化；HE染色观察病理变化；免疫组织化学法测定α-SMA、AFP、PCNA表达；Masson’strichrome及Sirius Red染色测定ECM含量并对肝纤维化程度分级，图象分析仪半定量分析。 二、HNF4α抑制肝细胞EMT和肝癌前体细胞产生的研究 1．Real time RT-PCR和免疫组织化学方法，分别检测正常、DEN诱癌大鼠肝组织HNF4α及EMT相关基因(E-cadherin、vimentin、snail、TGF-β1)的表达；同时检测HNF4α导入后HNF4α及EMT相关基因的表达。 2．免疫组织化学方法检测10例人原发性肝癌标本中HNF4α及EMT相关基因(E-cadherin、vimentin)的表达。 3．分离原代培养大鼠肝细胞，培养2d后，换成含有2 ng/ml TGF-β1无血清培养基，同时将AdGFP或AdHNF4α以感染复数(multiplicity of infection，MOI)10感染肝细胞，动态观察细胞形态变化；收集感染48 h、72 h后细胞，抽提总RNA和蛋白。Real time RT-PCR法检测肝细胞HNF4α、白蛋白(albumin，ALB)、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、snail、Ⅰ型胶原mRNA水平表达；细胞间接免疫荧光检测EMT相关基因(E-cadherin、vimentin、snail)表达；Western Blot检测相应蛋白水平变化。 4．免疫组织化学方法检测大鼠肝组织内肝前体细胞/肝癌干细胞相关基因(OV-6、EpCAM)的表达和分布情况。 三、HNF4α对Wnt/β-catenin信号转导通路的活性的影响 1．利用报告基因检测系统分析HNF4α在293T、HepG2和BRL中对β-catenin转录活性的抑制。 2．通过核质分离后利用Western blot方法检测HNF4α对TGF-β1激活的肝细胞β-catenin核转位的调节。 3．免疫组织化学方法检测各实验组大鼠肝组织内β-catenin的表达和分布情况。 [实验结果] 一、HNF4α抑制实验性大鼠肝癌发生 1．随DEN诱癌进程，模型对照及病毒对照组大鼠逐渐出现肝纤维化、肝硬化及肝癌的病理表现。在诱癌第22 w，模型组及病毒对照组(6只/组)大鼠肝硬化明显，全部出现癌结节，HNF4α组(6只/组)均没有发现肿瘤。 2．Masson's trichrome及Sirius Red胶原染色结果半定量分析发现AdHNF4α组面积约为AdGFP组的49％(P＜0.05)，免疫组化表明α-SMA表达较AdGFP组均显著下降(P＜0.05)。 3．免疫组化结果半定量分析，结果表明HNF4α组AFP及PCNA表达较AdGFP组显著减少(P＜0.05)。 二、HNF4α抑制肝细胞EMT及肝癌前体细胞的产生 1．在DEN诱导大鼠肝癌形成过程中HNF4α及EMT相关指标的变化：Real timeRT-PCR及免疫组织化学检测提示随肝纤维化及肝癌发生肝组织内HNF4α表达逐渐下降；同时，上皮细胞标志物E-cadherin较正常组明显减少(P＜0.05)，间质细胞标志物较正常组明显增加(P＜0.05)。 2．HNF4α对DEN肝癌模型肝组织EMT相关基因表达影响：Real time RT-PCR及免疫组织化学检测显示AdHNF4α导入组E-cadherin表达较AdGFP导入组及模型组显著增加(P＜0.01)，而Snail、Vimentin表达均显著减少(P＜0.05)。 3．将含有TGF-β1无血清培养基刺激原代大鼠肝细胞，48 h后可见较多死亡细胞，细胞数量减少，形态由多边形向梭形转变；72 h后见死亡细胞进一步增多，活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态。Real time RT-PCR及间接免疫荧光检测Vimentin、Snail表达均明显增强(P＜0.05)，而E-cadherin、HNF4α表达明显减少(P＜0.05)。 4．将MOI10的AdHNF4α和AdGFP分别感染TGF-β1刺激的原代大鼠肝细胞，48 h后AdHNF4α组细胞死亡数量较AdGFP组明显减少，细胞形态仍保持多边形；72 h后AdGFP组活细胞数量较少且大多数呈现间质细胞梭形形态，AdHNF4α组细胞死亡细胞很少且大多仍保持多边形形态。Real time RT-PCR检测AdHNF4α组HNF4α表达明显上调，Vimentin和Snail表达均明显减少(P＜0.05)，E-cadherin明显增加(P＜0.05)。 5．AdHNF4α组肝前体/肝瘤干细胞OV-6及EpCAM阳性细胞比例较AdGFP组明显减少(P＜0.05)。 三、HNF4α下调Wnt/β-catenin信号转导通路的活性 1．AdHNF4α可以明显抑制293T和HepG2细胞β-catenin报告基因的活化，并随着AdHNF4α的滴度增加逐渐增强，即呈现一定的剂量依赖性。 2．AdHNF4α可明显抑制由TGF-β1刺激引起肝细胞β-catenin的核内转位，从而抑制Wnt/β-catenin通路的活化。 3．免疫组织化学检测提示DEN诱导大鼠肝癌形成过程中，肝细胞膜上β-catenin逐渐减少并出现胞浆和/或核内聚集，AdHNF4α组较AdGFP组β-catenin的核转位明显减少(P＜0.05)。 [结论] 1．实验性大鼠肝硬化、肝癌进程及人肝癌的发生过程中，肝细胞HNF4α表达逐渐降低并出现EMT现象。 2．HNF4α可明显抑制大鼠肝纤维化和肝硬化程度，有效预防肝癌的发生。 3．HNF4α预防肝癌发生的主要机制是通过下调Wnt/β-catenin通路的活性而抑制肝细胞EMT及肝癌干细胞的产生。

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文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分：HNF4α抑制实验性大鼠肝癌发生

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分：HNF4α抑制肝细胞EMT及肝癌前体细胞产生

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分：HNF4α调控Wnt/β-catenin信号转导通路的活性

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述：上皮细胞间质转化的研究进展

参考文献

博士在读期间发表文章情况

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