脂肪干细胞在壳聚糖支架材料上构建组织工程髓核的实验研究

摘要

椎间盘退变是退行性脊柱疾患的启动因素，在发病中起到关键性的作用，椎间盘退变可引起一系列的脊柱退行性变及继发性病变，如椎间盘突出症、脊柱节段性不稳症和椎管狭窄症等，这些疾病严重威胁广大人民群众的身体健康，并在世界范围内带来了巨大的社会经济影响。对这类疾病的治疗方法主要是：早期保守治疗、后期手术治疗。在过去30年中，手术治疗主要以减压及融合的方式为主，目的是解除对神经系统产生的占位压迫、重建脊柱稳定性。但随着更长时期的随访和病例的不断积累，融合术后尤其是多节段融合术后相邻节段的退变及对功能的损害，越来越被人们所认识，从而成为临床上具有挑战性的问题。在20世纪90年代，人工椎间盘技术开始被引入，以追求非融合的功能重建为目标。在早期病例中，出现了一些令人鼓舞的结果，但随之而来的是部分病例术后原有症状并没有获得改善，甚至进一步恶化。因此，构建组织工程髓核植入物，修复退变的髓核组织，恢复椎间盘的结构和功能，保持正常的脊柱节段运动功能，从根本上来治疗退行性脊柱疾患是目前国内外研究的重点及热点。
　　 近年来，脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)引起研究者的关注，ADSCs与MSCs一样均属于来自中胚层的成体干细胞，因此具有较为相似的生物学特性，但和MSCs相比其来源广泛，取材简易。有学者发现两种干细胞在生长动力学、细胞老化、基因转染和细胞的粘附特性等方面没有明显的差别。ADSCs体外扩增和自我更新能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。对ADSCs进行克隆分析表明，52％的细胞克隆表现出两个或三个方向的分化潜能。目前已证实ADSCs在一定条件下能够向中胚层细胞系包括脂肪、软骨、骨、肌肉和其他胚层细胞系包括神经、内皮等转化。这些都说明了脂肪组织来源的干细胞具有多向分化的潜能。关于ADSCs向软骨细胞诱导分化的研究比较多。有研究者用特殊的三维微球培养系统，模拟软骨细胞生长环境，诱导ADSCs向软骨细胞分化，可以检测到aggrecan和Ⅱ/Ⅹ型胶原基因特异表达。髓核细胞具有软骨细胞表型，其表达软骨形成的标记基因，包括SOX-9、aggrecan、Ⅱ型胶原基因，这为ADSCs向髓核细胞诱导提供了前提。
　　 椎间盘组织工程研究的另一个重点是寻求能够作为细胞移植与引导组织生长的天然的或人工合成的支架材料，成为细胞外基质的替代物。理想的支架材料应该在结构上与椎间盘基质成分相似并维持细胞的功能。构建符合髓核细胞外基质成分并且具有髓核组织生物学特性的支架材料，是制约椎间盘组织工程的瓶颈。壳聚糖(chitosan)与糖胺聚糖分子结构相似，是惟一带正电荷的碱性多糖，其结构类似于糖胺聚糖，而糖胺聚糖和Ⅱ型胶原是髓核细胞外基质中的主要有形成分。壳聚糖凝胶的阳离子特性，使其容易捕获软骨或椎间盘细胞产生的高价阴离子蛋白聚糖，从而有利于椎间盘基质功能的维持。有学者发现，将壳聚糖支架植入缺损处，一般只会引起很轻微的异物排斥反应，在修复过程中，壳聚糖支架可以加快伤口愈合，这可能是通过刺激免疫细胞分泌生长因子、细胞因子，促进缺损周围的细胞增殖，从而加速植入支架与正常组织的融合。
　　 目的：证实通过组织工程方法可以减缓与治疗椎间盘的退变。
　　 方法：应用组织工程技术，以ADSCs为种子细胞，种植在构建的壳聚糖三维支架材料上，并向椎间盘髓核细胞诱导分化，经组织化后修复构建的兔椎间盘退变动物模型，最后检测组织工程髓核的功能。从而评价组织工程髓核的生物学价值，为组织工程学治疗椎间盘退变性疾病的临床应用提供实验依据。
　　 结果：1、本课题采用梯度离心法和体外贴壁培养法，可有效分离兔ADSCs，并具有三向分化的潜能，证实本实验所分离、培养的细胞为ADSCs。2、经过冷冻干燥法构建的三维壳聚糖支架，具有很高的孔隙率，在水中基本不溶胀，能够保持细胞支架的形态，是理想的椎间盘组织工程支架材料。3、新西兰大白兔髓核抽吸法可以建立腰椎间盘退变的动物模型，方法可靠、重复性强、手术简单并适合常规应用，可为进一步实验研究提供基础。4、采用组织工程方法移植到退变椎间盘中的ADSCs壳聚糖支架组织化复合物可以有效抑制椎间隙狭窄，MRI显示可减缓椎间盘退变，生物化学检测显示可以减缓蛋白多糖含量的下降，抑制椎间盘退变，进而修复退变的椎间盘。
　　 结论：ADSCs壳聚糖支架组织化复合物可以有效抑制兔椎间盘退变模型的椎间隙狭窄，减缓椎间盘退变，为组织工程方法治疗椎间盘退变性疾病提供实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前言

第一部分 ADSCs的分离、培养及生物学活性的实验研究

一、前言

二、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

五、参考文献

六、附图

第二部分 壳聚糖支架的构建及ADSCs在三维支架上向髓核细胞分化的培养与检测

一、前言

二、材料和方法

二、结果

三、讨论

四、结论

五、参考文献

六、附图

第三部分 ADSC与壳聚糖复合物修复椎间盘退变模型的实验研究

前言

实验一 兔椎间盘退变模型的构建

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

五、参考文献

六、附图

实验二 ADSCs与壳聚糖复合物植入兔腰椎退变模型

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

五、参考文献

六、附图

全文总结

综述：细胞治疗椎间盘退变的研究进展

致谢

附录