低氧和糖皮质激素上调stomatin的机制及其生物学意义

摘要

缺氧是最重要的应激反应之一，是也临床最常见的病理生理过程，与心血管疾病和高原性肺水肿等的发生密切相关。糖皮质激素作为体内最重要的应激激素，在机体对低氧适应中发挥重要作用。人工合成的糖皮质激素-地塞米松（Dex）在临床上被广泛用于治疗肺水肿和肺损伤，它的这种作用是通过降低血管内皮细胞的通透性、加速肺泡腔中液体的清除以及增强肺上皮屏障功能来实现的。Stomatin是一个重要的脂筏标志蛋白，它广泛表达在人和小鼠的各组织细胞中，参与脂筏结构的装配，囊泡运输、物质的跨膜转运、以及对离子通道和细胞骨架的调节等生理过程。但是迄今对stomatin的功能了解的有限，对其在生理和病理条件下的调节研究的更少。我们前期研究了低氧和地塞米松（Dex）单独及联合作用对大鼠肺脏和人肺腺癌A549细胞stomatin表达的影响。结果发现低氧和Dex在体内和体外均可以上调stomatin的表达。本课题将从细胞和整体水平进一步确定糖皮质激素和低氧单独或共同作用对stomatin基因表达的影响，在此基础上，重点研究低氧和地塞米松上调stomatin表达的机制，并初步探讨stomatin表达上调的生物学意义。采用ReAltime-PCR和Western Blot的方法，我们首先在大鼠肺脏和原代培养的肺泡上皮细胞水平进一步证实了地塞米松和低氧不仅单独可诱导stomatin的表达，二者还能联合上调stomatin表达。接下来我们研究了低氧和地塞米松上调stomatin的机制。研究发现，stomatin mRNA 有一个相当长的半衰期，约为32小时，低氧和地塞米松处理都能够增强stomatin mRNA的稳定性, 使它的半衰期分别延长至原来的1.22倍和1.5倍。我们用荧光素酶报告基因实验研究发现，低氧不能诱导stomatin 启动子的转录活性，与低氧不同的是，地塞米松能够以时间和浓度依赖性的方式诱导stomatin启动子的活性，这个结果表明地塞米松也能够直接在转录水平上诱导stomatin mRNA的表达。为了进一步定位stomatin 启动子对糖皮质激素诱导反应的位点，我们构建了一系列含stomatin 启动子5’端不同截短形式的报告基因载体，荧光素酶活性分析试验表明，启动子的-162 至+244 区域是对糖皮质激素诱导反应所不可缺少的，而且这一区域在多种细胞类型中均贡献了stomatin基因的绝大部分基础转录活性，因此我们推测这一区域是它的核心启动子区。随后，我们用软件预测了这一区域所包含的可能介导糖皮质激素诱导反应的转录因子结合位点，并且构建了这些位点的相应突变型报告基因载体。结果发现，其中一个位点GRE3，突变之后能够使stomatin 启动子失去对地塞米松的诱导反应，这说明GRE3 介导了地塞米松对stomatin的诱导反应。因此我们认为，地塞米松在转录水平上对stomatin的诱导是通过激活的糖皮质激素受体与这个GRE3 位点结合来实现的。最后，我们用激光共聚焦显微镜的方法观察了A549细胞中stomatin的表达与actin细胞骨架的关系。结果发现，stomatin在膜周与actin细胞骨架存在共定位。低氧暴露或Dex 处理均能使膜周actin 增加,干扰内源性stomatin表达后低氧暴露或Dex处理A549细胞都能使actin细胞骨架在膜周分布显著减少，表明低氧和Dex能通过上调stomatin表达, 增加与细胞膜连接的细胞骨架，从而增强肺泡上皮细胞膜的稳定性。这可能是低氧和GC增强肺泡上皮细胞屏障的功能，从而使得机体产生对低氧适应性反应的机制之一。

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实验方法

研究结果

讨 论

小结

参考文献

文献综述 脂筏蛋白Stomatin 的研究进展

致 谢

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