MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的安全性评价

摘要

原发性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破坏以及先天性瓣膜缺乏等静脉疾患，静脉瓣移植常常是最后的选择。鉴于自体静脉瓣移植来源有限、损伤较大、瓣膜强度不足和管径难以匹配等问题，组织工程化静脉瓣是修复与重建静脉瓣膜结构、功能的理想方案。本室构建的MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣在犬及绵羊体内移植，取得了较为理想的结果，然而，评判一种组织工程化组织或器官是否具有临床应用前景，还必需进行安全性的检测。本研究参照医疗器械IS010993系列标准，对异种脱细胞静脉瓣支架材料和体外构建的MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣进行了体外毒性试验、血液相互作用试验、植入后局部反应试验和免疫性评价的研究，证明，MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣可较安全地应用于人体。
　　 原发性瓣膜功能不全、血栓形成完全再通后的瓣膜破坏以及先天性瓣膜缺乏等静脉疾患，静脉瓣移植常常是最后的选择。但是，自体静脉瓣移植除来源有限、损伤较大外，尚有瓣膜强度不足和带瓣静脉的管径往往难以符合要求等问题。近年来，心血管组织工程技术的发展为构建组织工程化静脉瓣膜提供了可能。研究证明，虽然每条深静脉的瓣膜有多对，但只要移植一对有功能的瓣膜就能明显改善血液逆流的问题，这就使得构建组织工程化静脉瓣更具有实用价值。因此应用细胞生物学与工程学原理开发出具有生物活性、无免疫原性的组织工程化静脉瓣是修复与功能重建深静脉功能不全的理想方案。
　　 本实验室利用生物学及工程学原理，以自体骨髓分离、培养的EPC(endothelialprogenitor cells，EPC)和MAPC(multipotent adult progenitor cells，MAPC)作为种子细胞，以异种脱细胞静脉瓣作为支架材料，构建的MAPC/EPC组织工程化静脉瓣，在犬及绵羊体内对其效用性研究已经取得了较为理想的结果，具有良好的临床应用前景。然而，评判一种组织工程化组织或器官是否具有临床应用前景，除证明其有效性外，安全性的评价至关重要。
　　 组织工程化组织或器官的构成，具有3个基本要素：支架材料(相当于细胞外基质，ECM)、种子细胞(培养、增殖形成组织或器官的细胞)和生长因子(有助于种子细胞的增殖)。根据组织工程化产品安全性评价的惯例，需要对这3个要素及其相互作用的安全性进行评价。
　　 目前，国际上对组织工程产品还没有整体的管理规定和评价方法。美国食品药物管理局(FDA)是最早进行组织工程医疗产品安全性评价和监督管理的机构，1994年组建了FDA组织工程工作组(TEWG)，主要是参照医疗器械的管理进行组织工程医疗产品的安全性评价和监督管理工作，但目前仅有组织工程化皮肤、软骨、一些支架材料的完整评价标准。我国组织工程化产品的安全性评价工作刚刚起步，不同组织工程化组织、器官安全性评价的参数选择和实施方法正在制定之中。
　　 本项目采用的种子细胞来源于试验动物自身，培养过程中没有进行基因改造，按照我国《组织工程医疗产品标准》起草专家委员会的初步共识，其安全性评价暂不作硬性要求。对纯天然的支架材料及以纯天然材料为支架构建的组织工程化产品，根据惯例，遗传毒性试验暂不作硬性要求。因此，本研究参照医疗器械IS010993系列标准，仅对异种脱细胞静脉瓣支架材料和体外构建的MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣进行了体外毒性试验、血液相互作用试验、植入后局部反应试验和免疫性评价的研究。
　　 第一部分异种脱细胞静脉瓣支架材料的安全性评价
　　 研究目的：制备异种脱细胞静脉瓣支架，为体外构建组织工程化静脉瓣提供支架材料，评价其作为组织工程支架材料的安全性。
　　 研究方法：取正常成年绵羊(雌性不限)股静脉40条，修剪为2 cm左右的段，确保每段保留一对静脉瓣。首先采用0.5％TritonⅩ-100+0.05％NH40H振摇(4℃)处理3天，然后超纯水振摇(4C)漂洗3天，再换用DNase+RNase(37(℃)作用12 h，超纯水漂洗2 h，完全去除股静脉壁及瓣膜中的细胞成分，将得到的脱细胞细胞外基质材料置Eppendorf管中，封口膜密封，60C0辐照灭菌，-80℃保存，即得到异体脱细胞静脉瓣支架。将异种脱细胞静脉瓣支架分别进行以下的试验：体外细胞毒性试验；血液相容性试验；植入后局部反应试验；免疫学试验。
　　 结果：异体脱细胞静脉瓣支架外形完整，H-E染色未见到细胞成分，纤维连续无断裂。HLA-1免疫组化染色为阴性，说明免疫原性极弱。体外细胞毒性试验显示种子细胞和支架材料组织相容性好；血液相容性试验中，体外实验显示脱细胞支架材料不会引起红细胞溶解，体内实验显示局部有血栓形成；植入体内后局部反应试验显示早期局部炎性反应，随着时间延长，支架周围细胞逐渐减少；免疫学试验显示：脱细胞支架材料浸提液不会引起体外淋巴细胞增殖，植入体内后BALB/C小鼠血清中IgG水平无明显升高。
　　 结论：脱细胞支架材料形态特征符合支架材料的条件；与种子细胞组织相容性好；体内血液相容性实验虽然局部有血栓形成，应该与支架材料没有内皮化有关；局部植入后无免疫排斥反应；免疫原性低；可以作为构建组织工程化静脉瓣的支架材料。
　　 第二部分 MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的安全性评价
　　 研究目的：体外构建MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣，评价其安全性。
　　 研究方法：以实验动物自体EPC和MAPC作为种子细胞，异种脱细胞带瓣静脉作为支架，采用多点注射和加压灌注将MAPC和EPC种植到异体脱细胞静脉瓣支架壁内和内表面，体外培养2周，构建MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣；取出细胞-支架材料复合物，分别进行体外血液相容性试验、植入新西兰白兔下腔静脉体内血液相容性试验、BALB/C小鼠皮下植入试验；以及免疫学试验。
　　 结果：体外复合培养2周后，H-E染色见EPC完整覆盖支架内表面，MAPC能够生长至支架内部，生长状况良好。血液相容性试验中，体外实验显示细胞-支架材料复合物不引起红细胞溶解，植入体内后局部血流通畅，无血栓形成；局部植入后无免疫排斥反应；免疫学试验见免疫原性低。
　　 结论：以自体EPC和MAPC为种子细胞、异种脱细胞带瓣静脉为支架材料，构建的MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣，生物相容性好、免疫原性低、无血栓形成，可较安全地应用于人体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

研究背景

第一部分 异种脱细胞静脉瓣支架材料的安全性评价

前言

一、绵羊脱细胞静脉瓣支架材料的制备及检测

(一)材料和方法

(二)结果

二、 种子细胞的分离、培养和鉴定

(一)材料和方法

(二)结果

三、 脱细胞静脉瓣支架材料的体外毒性试验

(一)材料和方法

(二)结果

四、脱细胞静脉瓣支架材料的血液相容性试验

(一)材料和方法

(二)结果

五、 脱细胞静脉瓣支架材料的局部植入试验

(一)材料和方法

(二)结果

六、脱细胞静脉瓣支架材料的免疫学评价

(一)材料和方法

(二)结果

七、 讨论

参考文献

第二部分 MAPC/EPC组织工程化静脉瓣的安全性评价

前言

一、MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的构建及检测

(一)材料和方法

(二)结果

二、MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的血液相容性试验

(一)材料和方法

(二)结果

三、MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的局部植入试验

(一)材料和方法

(二)结果

四、MAPC/EPC性组织工程化静脉瓣的免疫学评价

(一)材料和方法

(二)结果

七讨论

参考文献

全文小结

本课题的创新点和意义

综述细胞外基质材料的安全性评价方法

在读期间发表论文、申请基金和专利申请

致谢