二膦酸盐治疗慢性肾脏病矿物质及骨异常的临床及基础研究

摘要

全世界每年约10-13％的人群罹患慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)，钙磷代谢紊乱是CKD的重要并发症之一，是导致继发性甲旁亢的重要原因，可以导致血管钙化和肾性骨营养不良等一系列并发症，严重影响患者的生活质量以及生存时间，近30年来对其发病机制及临床防治措施的研究有了很大进展。由于该并发症常伴钙、磷及甲状旁腺激素异常且极易导致软组织(主要为血管)的异位钙化，因此2005年国际肾脏病学会“提高肾脏病整体预后”工作组(KDIGO)将此并发症称之为CKD矿物质和骨代谢紊乱(CKD-mineral and bone disorders，CKD-MBD)取代以往的肾性骨营养不良(renal osteodystrophy)及肾性骨病(renal bone disease)。肾性骨病已为影响患者生活质量和生存时间的重要并发症之，血管钙化是CKD患者晚期心血管事件死亡的独立危险因子，与CKD患者心血管疾病的高发病率、病死率密切相关，终末期肾病尤其是透析患者均存在程度不等的血管钙化，但目前临床治疗肾性骨病及血管钙化的手段极其有限。二膦酸盐现为治疗骨质疏松的一线药，同时体内和体外实验证实有抑制血管及软组织钙化的作用，可否应用于肾性骨病及血管钙化的治疗呢?为此，在临床上，我们在常规治疗的基础上，观察单用降钙素或联合使用二膦酸盐对肾性骨病的疗效和安全性。同时，我们用体外细胞实验研究了二磷酸盐对高磷诱发血管平滑肌细胞钙化的抑制作用及可能的机制。本研究分为三个部分：一、二膦酸盐治疗血液透析患者肾性骨病的长期疗效；二、高磷培养诱发血管平滑肌细胞促其钙化的机制研究；三、帕米磷酸钠对高磷诱发大鼠血管平滑肌细胞钙化干预的实验研究。
　　 一、二膦酸盐治疗血液透析患者肾性骨病的长期疗效
　　 观察降钙素及二膦酸盐治疗维持性血液透析(MHD)患者肾性骨病的疗效及安全性。方法43例MHD患者按数字随机法分成A、B两组，均常规服用碳酸钙1.0g tid、骨化三醇0.25μg qd。A组加用降钙素20 U，皮下注射，每周3次(常规血液透析时使用)；B组在使用降钙素的同时加用二膦酸盐70 mg，口服，每周1次。在治疗前及治疗3、6、12个月时分别检测血全段甲状旁腺激素(iPTH)、血钙、血磷、血清碱性磷酸酶(AKP)水平和腰椎、股骨颈骨密度，以及记录骨痛程度(采用视觉模拟疼痛评分，VAS)和不良反应。结果两组患者AKP和PTH水平比治疗前显著下降，治疗前和12个月时，A组AKP(U/L)为244.05±41.99和148.35±27.71；B组为245.60±40.86和143.40±28.03；A组PTH(ng/L)为697.5±119.7和267.4±45.9；B组为708.2±120.3和277.6±41.9；差异均有统计学意义(均P＜0.05)。两组血钙、血磷水平治疗前后差异无统计学意义。两组患者腰椎、股骨颈骨密度在治疗3、6个月时变化不明显，12个月时显著好转。与治疗前比较，12个月时A组腰椎骨密度(g/cm2)为1.202～0.251比1.062±0.223；B组为1.189±0.225比1.033±0.152；A组股骨颈骨密度(g/cm2)为1.067±0.095比0.993±0.108；B组为1.018±0.217比0.947±0.083，均P＜0.05。两组治疗前后主观评价骨痛程度减轻，VAS比治疗前显著下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。除B组个别患者有轻度消化道反应外，余无不良反应.
　　 二、高磷培养诱发血管平滑肌细胞促其钙化的机制研究；
　　 大鼠主动脉不仅取材简单，来源充沛，而且其中之平滑肌细胞活力强，较适合培养。血管平滑肌细胞的培养方法有多种，其中主要有酶消化法和植块贴壁法，不同的培养方法有不同的优点和用处。酶消化法可获得细胞形态分化良好的收缩型细胞，但是消化酶的作用时间往往不易掌握，且消化酶较贵，细胞获得量亦不够多：而植块贴壁法操作简便、经济实用，尽管存在原代细胞达到能传代的时间长、成功率不高的缺点，但细胞传代培养可获得量较大的均一细胞，适用于细胞需要量较大的研究。运用植块贴壁法成功体外培养了大鼠主动脉血管平滑肌，且在体外可保持血管平滑肌细胞的基本特性。
　　 我们对高磷培养后的血管平滑肌细胞层中的钙沉积作了定量研究，结果发现高磷培养可以显著促进血管平滑肌细胞钙化，且细胞外基质中的钙含量随着磷浓度、培养时间的增加而增加。运用western-blot方法分别测定成转录因子核心结合因子a1蛋白水平的表达。发现骨钙素、转录因子核心结合因子a1在高磷的状态下均过表达。
　　 三、帕米磷酸钠对高磷诱发大鼠血管平滑肌细胞钙化干预的实验研究
　　 本实验旨在证明二膦酸盐可否直接作用于VSMC,抑制其主动形成的血管钙化。我们发现加入帕米磷酸钠后，可明显呈剂量依赖性抑制钙磷在细胞外基质的沉积。采用WESTERNBLOT测定成骨细胞特异性的核转录因子Cbfa-1及下游表达产物骨钙素(Osteocalcin)，发现二膦酸盐可抑制VSMC向成骨细胞转化。说明帕米磷酸钠可能直接作用于Ⅲ型钠依赖的磷酸协同转运体，降低了VSMC内的磷浓度，抑制了VSMC向成骨细胞转化，从而抑制了血管钙化。
　　 我们目前的实验证实二膦酸盐类的药物可以直接作用于血管平滑肌细胞，抑制钙磷在细胞外基质的沉积。同时，还观察到了二膦酸盐还可抑制血管平滑肌向成骨细胞的转换。进一步深入的研究将有助于阐明二膦酸盐抑制血管钙化的机制，并为临床上提供一种有效的治疗血管钙化的药物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要英文缩写与符号说明

声明

前言

第一部分降钙素及二膦酸盐治疗血液透析患者肾性骨病的长期疗效

一、对象

二、方法

结果

讨 论

参考文献

第二部分高磷培养诱发血管平滑肌细胞促其钙化的机制研究

实验器材

实验方法

实验结果

讨 论

参考文献

第三部分帕米磷酸钠对高磷诱发大鼠血管平滑肌细胞钙化干预的实验研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

综述:慢性肾脏病高磷血症所致并发症的机制及防治进展

致谢