氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能影响及机制研究

摘要

研究背景：高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)除了具有促进胆固醇逆转运、保护血管内皮、抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多方面有益作用外，还有研究发现，HDL可以通过改善内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)数量及功能，从而有助于血管损伤后的修复。然而，在许多情况下HDL水平升高却并不介导保护作用，相反会导致心血管事件发生增加，造成这种现象的原因可能在于升高的HDL并不具备心血管保护作用，此时“高水平HDL”反而促进心血管事件的发生。目前已知，在糖尿病、冠心病等条件下，HDL易氧化修饰生成氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)而发生功能逆转成为致病因素，但ox-HDL对EPCs功能的作用以及机制如何并不清楚。
　　 目的：本研究旨在在前期有关EPCs研究的基础上，进一步观察ox-HDL对EPCs功能的影响并探讨其中的作用机制，为针对HDL功能改善的治疗以及减少EPCs功能损害奠定基础。
　　 方法：首先采用密度梯度离心法从人外周血中分离、培养、鉴定得到EPCs。接下来，我们从三个方面研究ox-HDL对EPCs功能的影响及机制：(1)ox-HDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选：采用人基因表达芯片检测ox-HDL干预后EPCs基因表达的变化，并通过realtime PCR和Western Blot方法进一步验证差异基因；(2)ox-HDL对EPCs功能的影响：在第一部分研究结果的基础上，将EPCs分为对照组、HDL干预组(50ug/m1)、不同浓度ox-HDL干预组(10ug/ml、20 ug/ml、50 ug/ml)、CD36中和抗体阻断组和CD36中和抗体阻断加ox-HDL干预组，其中CD36中和抗体于干预前2小时提前加入，然后采用MTT法检测细胞增殖情况、ANNEXIN V/PI法检测细胞凋亡水平、ROS荧光法检测细胞内氧化应激水平、Transwell小室迁移实验检测EPCs迁移能力、Matrigel方法检测体外血管形成能力，ELISA方法检测细胞培养上清中的细胞因子(VEGF和TSP-1)，此外，通过结扎离断右侧股动脉建立裸鼠单侧下肢缺血模型，模型建立后通过尾静脉输注给予干预后的EPCs，继续喂养2周后采用血管造影、免疫组织荧光的方法观察EPCs体内血管修复能力。(3)ox-HDL对EPCs功能影响的信号通路研究：干预分组的情况同第二部分，在干预结束后，收集细胞总蛋白和核蛋白，采用Western Blot方法检测MAPK通路(p38、JNK、ERK)相关蛋白的磷酸化水平，采用凝胶迁移实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)方法检测NF-κB活性。
　　 结果：(1)ox-HDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选：ox-HDL干预EPCs后，与细胞运输、转录调控、信号转导、应激反应、代谢、运动、分化、细胞周期、粘附等相关的基因表达均有变化，其中在与HDL或ox-HDL相关的受体中，ox-HDL干预后CD36表达显著增加，为未干预组2.3751倍，其余受体表达无显著变化。随后的realtime PCR和Western Blot的结果进一步验证了ox-HDL可以呈浓度依赖性促进CD36表达增加(P＜0.05)，而相对应的是HDL并无此作用。(2)ox-HDL对EPCs功能的影响：ox-HDL呈浓度依赖性促进EPCs凋亡，抑制其迁移、体外血管新生以及裸鼠肢体缺血后体内血管新生能力，促进EPCs内ROS水平(P＜0.05)，而对血管新生相关因子的影响主要表现在促进TSP-1表达及分泌(P＜0.05)，但对VEGF表达影响不显著，这些损害作用在预先给予CD36抗体处理后均有部分减轻。(3)ox-HDL对EPCs功能影响的信号通路研究：ox-HDL呈浓度依赖性促进p38 MAPK的磷酸化，而对MAPK通路的其他两方面ERK和JNK的磷酸化则无显著的影响，EMSA结果提示，ox-HDL呈浓度依赖性提高NF-κ B的活性，且在预先给予CD36中和抗体处理后，ox-HDL对p38MAPK和NF-κ B的促进作用显著降低。
　　 结论：我们的结果揭示了与HDL相反，ox-HDL具有损害EPCs功能的作用，该损害作用通过CD36受体途径介导，与p38MAPK和NF-κ B信号通路密切相关，这可能是缺血性疾病血管新生功能受损的重要机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞相关表面受体基因表达的筛选

引言

材料与方法

结果

讨 论

参考文献：

第二部分氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能的影响

引言

材料与方法

结果

讨 论

参考文献：

第三部分氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能影响的信号通路研究

引言

材料与方法

结果

讨 论

参考文献：

论文总结

综述：高密度脂蛋白功能研究及治疗进展

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