隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44表达研究

摘要

　　 新生隐球菌是一种严重危害人类健康的医学真菌，隐球菌病发病率逐年增加，其中90％侵犯中枢神经系统，引起致命性的脑膜脑炎。新生隐球菌侵犯中枢神经系统的机制和治疗的研究受到高度重视。
　　 隐球菌感染中枢神经系统的前提是必须通过血脑屏障。目前，国内外学者围绕隐球菌与脑血管内皮细胞相互作用方面做了大量的研究，发现了隐球菌通过胞吞胞吐等方式穿越脑血管内皮细胞。
　　 最新的研究显示，在隐球菌感染脑血管内皮细胞过程中，菌体荚膜透明质酸HA与宿主CD44相互作用，促进隐球菌侵袭宿主细胞和细胞骨架重组。易于菌体穿越脑血管内皮细胞。CD44在隐球菌感染宿主过程中发挥重要作用。
　　 研究发现，CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，属于未分类的粘附分子。CD44作为细胞表面的黏着性受体，与许多疾病的进展和转归都有密切的关系，甚至能成为多种疾病治疗的靶点。
　　 目前，国内外学者研究隐球菌穿越血脑屏障感染中枢神经系统的机制主要集中在细胞水平上，在动物模型上的研究报道较少。
　　 本研究组已经成功建立隐球菌脑膜炎小鼠模型。在此基础上，已经开展了多项关于隐球菌脑膜炎的发病机制的课题研究，分析了新生隐球菌中枢神经系统感染动物模型脑组织含水量的变化规律。发现AQP4蛋白在调节隐球菌脑膜炎脑内水液平衡中发挥重要作用。为进一步研究探索隐球菌脑膜炎的发病机制打下良好的基础。我们拟在动物模型上研究隐球菌与小鼠作用前后CD44的表达变化，阐明CD44是隐球菌脑膜炎发生的重要分子。利用现代分子生物学技术在分子水平上研究隐球菌与宿主的相互作用已经非常成熟。我们应用RT-PCR技术、Western-blotting技术和免疫组化技术检测隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44表达，阐明小鼠脑组织CD44表达与隐球菌脑膜炎发病的相互联系，说明CD44在隐球菌脑膜炎的发病中发挥重要作用。探索和阐明隐球菌脑膜炎的可能的发病机制，为本病的预防和治疗指明新的方向。
　　 目的：
　　 1、应用RT-PCR技术、Western blotting和免疫组化技术测定隐球菌脑膜炎小鼠脑组织中CD44表达；
　　 2、阐明CD44与隐球菌脑膜炎发生的关系，探索隐球菌脑膜炎可能的发病机制。
　　 方法：
　　 第一部分：
　　 1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本从-70℃冰箱取出备用。
　　 2、将各组组织转移至12×55mmm试管中，匀浆后，经异丙醇，75％乙醇，20ulDEPC处理水处理，抽提组织RNA。
　　 3、将经过稀释后的RNA样本，加入逆转录酶MMLV1ul，oligo(d T0.5 ul，dNTPs0.5ul，5×逆转录buffer4ul，DEPC处理水10ul反应，制备逆转录cDNA。
　　 4、将制备好cDNA2ul加入SYBRGreen Mix32.5ul，上游引物F0.5ul，下游引物R0.5ul，ddH2O水14.5ul，进行PCR扩增。
　　 第二部分：
　　 1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本从-70℃冰箱取出备用。
　　 2、将称取各样本冰浴条件下匀浆；13200rpm离心，取上清液，-80℃保存。
　　 3、样品采用10倍稀释，求得在20μl总体积中的样品体积，每个样品上样量为40μg。
　　 4、将分装好的样品经过SDS-PAGE电泳、转膜及封闭、然后加入一抗和二抗作用、ECL显色后，放入定影液显影定影。检测脑CD44的表达。
　　 第三部分：
　　 1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织标本及正常小鼠脑组织从-70℃冰箱取出备用。
　　 2、免疫组化染色：将各组标本取出制作石蜡切片，常规脱蜡脱水，加入一抗和二抗以及显色液，进行免疫组织化学显色。
　　 3、封片后镜下观察切片结果，最后拍摄照片。
　　 结果：
　　 第一部分：隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44的mRNA在12h的mRNA表达水平与对照组，48h,4d,7d组相比较升高，有统计学意义。(p＜0.05)，其它时间点小鼠脑组织mRNA表达两两比较没有显著变化。
　　 第二部分：
　　 隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44试验组各时间点蛋白表达与对照组相比无显著变化(p＞0.05)，没有统计学意义。
　　 第三部分：
　　 试验结果表明对照组小鼠脑组织CD44均匀分布在脑细胞膜上。实验组中隐球菌作用小鼠6h,12h后，小鼠脑组织CD44的分布没有明显变化，作用24h后，隐球菌诱导脑组织CD44向脑组织的一侧移行，作用48h,72h后，CD44的分布发生了明显变化，在隐球菌脑膜炎脑膜侧的脑组织分布大量的CD44，而在脑实质侧CD44的分布明显减少。更重要的是在病灶周围的脑组织CD44分布也观察到一侧增加，另一侧分布减少。
　　 结论：
　　 1、隐球菌脑膜炎小鼠脑组织试验组CD44的mRNA水平表达出现短暂性增高。隐球菌脑膜炎小鼠试验组CD44蛋白表达与对照组没有发生显著的变化。
　　 2、隐球菌侵入小鼠大脑后，隐球菌诱导CD44向脑组织的一侧移行，向脑膜方向脑组织聚集。病灶周围脑组织CD44也出现不均衡性分布。说明了隐球菌脑膜炎的发生与CD44分子有密切的关系。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44基因表达

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44蛋白表达

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第三部分免疫组化法检测隐球菌脑膜炎小鼠脑组织CD44表达

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

全文总结

参考文献

综述新生隐球菌通过血脑屏障的研究进展

硕士在读期间发表论文情况

致谢