莨菪碱类药物抗休克的β-arrestins抗炎机制

摘要

莨菪碱类药物主要包括阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱和樟柳碱等。它们都是从茄科植物中提取出的生物碱。天然左旋莨菪碱是不稳定的，提取过程中经化学处理后得到稳定的消旋莨菪碱，即阿托品。东莨菪碱主要是从洋金花和莨菪等植物中提取的生物碱，为左旋体。山莨菪碱和樟柳碱是从唐古特莨菪中提取的生物碱。莨菪碱类药物是托品酸和有机碱形成的酯类，山莨菪碱在托品基的6位碳原子上有不对称的羟基，而东莨菪碱无此羟基，却有一个氧桥。莨菪类药物均属毒蕈碱受体（muscarine receptor）阻断剂，其M受体阻断作用与其化学结构有关，如果其化学结构中存在氧桥，可产生较强的中枢镇静作用，而托品环上的羟基又可减弱中枢镇静作用。根据他们不同的结构可以看出，东莨菪碱的中枢作用最强，而山莨菪碱和阿托品的中枢作用则比较弱。临床上，莨菪碱类药物用途广泛，常用于解除平滑肌痉挛，抑制腺体分泌，抗休克和解救有机磷酸酯中毒。近年来，莨菪类药物的抗休克作用成为研究的重点之一。大剂量的阿托品能解除小血管痉挛，改善微循环，在补充血容量的基础上，有助于休克的好转，但是由于其对心血管系统的广泛作用，副作用较多，限制了它的应用。东莨菪碱能扩张小血管，改善微循环，有抗休克的作用，但它能通过血脑屏障，作用于中枢M胆碱受体产生较强的中枢抑制作用，也限制了应用。因此，莨菪碱类药物的抗休克作用以山莨菪碱最为典型。山莨菪碱属于非选择性的毒蕈碱受体阻断剂，其人工合成品为654-2，能够阻断M1-M5受体亚型，它解除平滑肌痉挛的作用和对心血管抑制的作用与阿托品类似而稍弱，同时也能解除小血管痉挛而改善微循环。自1965年以来，山莨菪碱在我国被用于治疗循环性休克，特别是感染性休克的治疗取得了很好的治疗效果。如北京友谊医院儿科使用山莨菪碱治疗爆发型流行性脑脊髓膜炎，使死亡率从66.9％下降到12.4％，用山莨菪碱治疗中毒性细菌性痢疾，使死亡率从20-30％下降到0.5％。目前关于山莨菪碱抗休克的机制主要包括改善微循环，抑制血栓形成和纤维蛋白溶解作用，稳定溶酶体及抑制组织蛋白酶等。但是其抗休克的分子机制报道较少。
　　 我们实验室前期的研究发现了山莨菪碱抗休克作用的全新的药理机制，也称为神经免疫机制，即：山莨菪碱通过阻断M胆碱受体，加强了乙酰胆碱对巨噬细胞尼古丁α7受体的激活作用，从而启动了尼古丁抗炎通路，实现抗休克作用。但是，在实验中我们发现，在使用了α7受体阻断剂甲基牛扁碱后，山莨菪碱的抗休克作用并不能完全取消，说明除了胆碱能抗炎机制之外，可能还有其他的机制参与了山莨菪碱的抗休克作用。
　　 β-arrestins是一组多功能的小分子蛋白质，它的经典作用是参与G蛋白偶联受体的脱敏。但是近年来的研究发现，β-arrestin作为脚手架蛋白，也参与了许多非G蛋白偶联受体激活的信号转导，如ERK，JNK，p38，Akt和P13激酶信号通路等，因此β-arrestins也参与了趋化作用，凋亡作用及肿瘤转移等过程。2006年，Nature上报道了β-arrestins可以和TRAF6结合，负向调节内毒素休克时的信号转导通路--TLR-IL-1R（Toll-like receptor-interleukin-1 receptor）信号通路，最终抑制转录因子NF-KB及AP-1的活化，从而抑制炎症因子的产生。此外，Witherow等报道了β-arrestins，特别是β-arrestin-1能够直接与。NF-KB的抑制因子IKB结合，使得IKB-NF-KB复合体滞留在胞浆中，从而阻止NF-KB进入细胞核而抑制其活化。Gao等研究发现β-arrestins-2能够与IKB结合，抑制IKB的磷酸化降解，从而抑制NF-KB信号的激活及炎症因子的表达，并发现刺激β2肾上腺素能受体能够加强β-arrestins-2.IKB复合体的稳定，从而为交感神经系统的抗炎作用提供了理论依据。Luan等的研究发现β-arrestins-2能够与IKB结合，抑制紫外线照射引发的NF-KB信号活化。阮等的研究发现在人脐静脉内皮细胞，山莨菪碱能够抑制内毒素诱导的内皮细胞活化，山莨菪碱也能够完全阻断内毒素诱导的NF-KB的活化。
　　 既然已经有许多研究报道β-arrestins参与免疫反应的信号转导，那么我们思考莨菪碱类药物的抗休克作用是否有β-arrestins的参与，参与后的作用是充分条件还是必要条件，是有待我们解决的问题。
　　 研究方法：
　　 本研究以内毒素诱导的休克为主要模型，在整体动物和巨噬细胞模型上，利用整体动物学实验方法和分子生物学手段，研究山莨菪碱对细胞中β-arrestin-1蛋白和mRNA表达的影响及β-arrestin-1蛋白在山莨菪碱抗休克中的作用；在体内外，使用RNA干扰技术和基因敲除小鼠，研究山莨菪碱对内毒素血症中血浆炎症因子表达水平的影响；使用分子生物学手段初步探讨山莨菪碱等抗休克作用的信号转导通路。
　　 结果：
　　 1.在培养的RAW264.7巨噬细胞，山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品均能增加β-arrestin-1蛋白的表达，尤以山莨菪碱的表达增加最显著；在内毒素诱导的休克小鼠模型上，给予相同剂量的以上三个药物治疗，均能明显提高动物的生存时间。在培养的RAW264.7巨噬细胞，用内毒素刺激，给予不同剂量的山莨菪碱孵育或同一剂量孵育不同时间，发现山莨菪碱能够剂量和时间依赖性的上调β-arrestin-1的蛋白和mRNA的表达；
　　 2.在内毒素诱导的休克小鼠为模型，给予山莨菪碱治疗后，发现山莨菪碱能够显著增加内毒素休克小鼠脾脏β-arrestin-1的蛋白和mRNA的表达。
　　 3.在β-arrestin-1 siRNA干扰的RAW264.7巨噬细胞上，发现山莨菪碱抑制内毒素诱导的炎症因子TNFα和IL-1β表达的作用显著下降；在β-arrestin-1基因敲除的小鼠上，用内毒素诱导休克模型，发现山莨菪碱降低炎症因子表达水平的作用下降，其改善休克死亡率的作用也明显下降。
　　 4.山莨菪碱能够显著逆转由内毒素引起的细胞内cAMP含量下降，并且使用cAMP-PKA通路的特异性阻断剂H-89后，山莨菪碱上调β-arrestin-1作用被阻断；此外，取尼古丁乙酰胆碱α7基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞，用内毒素刺激并给予山莨菪碱共孵育，发现山莨菪碱上调β-arrestin-1表达的作用完全消失。
　　 结论：β-arrestin-1参与了莨菪类药物特别是山莨菪碱的抗休克作用；山莨菪碱可能通过激活cAMP-PKA通路从而增加了β-arrestin-1的表达，并且山莨菪碱增加β-arrestin-1表达的作用与α7尼古丁受体有关。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论和展望

参考文献

附录

综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研情况说明

致谢