蛋白磷酸酶2A通路缺失导致前列腺肿瘤细胞转化生长因子beta的过分泌

摘要

研究背景：转化生长因子Beta(TGFβ)是一种多功能生长调节因子，自1981年被发现以来，已被证实参与胚胎发育、肿瘤形成、血细胞生成、纤维化、创伤愈合和免疫调节等多种生物学过程。其中，在肿瘤发生的早期阶段，TGFβ延续了其基态下的生长抑制功能而具有肿瘤抑制因子的作用，但在肿瘤发展的后期，该信号通路中的一些成员发生异常改变或功能缺陷，包括细胞周期蛋白基因、TGFβ受体以及Smads基因突变或缺失等，均可导致细胞能够抵抗TGFβ的生长抑制而产生不受控制的细胞增殖，当细胞对TGFβ的生长抑制信号失去反应时，肿瘤细胞自身会反馈性的增加TGFβ的分泌，此时大量的TGFβ不仅无法发挥生长抑制作用，反而可促进肿瘤细胞与胞外基质的相互作用、血管内皮细胞增生和肿瘤内血管的形成，同时抑制免疫细胞的活性使肿瘤细胞逃过免疫系统的监控，给肿瘤的生长和转移提供合适的微环境，因此进展期肿瘤细胞大量分泌TGFβ成为肿瘤进展的一个恶性循环链。研究表明，前列腺癌中TGFβ表达水平较正常前列腺组织明显增高，TGFβ的高表达，往往与临床预后不良有关。如果能够打破肿瘤细胞高分泌TGFβ这个恶性循环链，将有可能抑制肿瘤的进展。打破这个恶性循环链的一个前提条件是要探索出肿瘤细胞分泌大量TGFβ的机制。TGFβ最强的诱导因子是其自身，即自身诱导。本实验主要探究在正常和恶性前列腺癌细胞中，TGFβ的自身诱导有无差异，从而导致TGFβ分泌水平的不同，为抑制肿瘤细胞依赖高分泌TGFβ进展建立基础。
　　 目的：(1)检测良、恶性前列腺细胞TGFβ分泌水平的差异；(2)分析TGFβ自身诱导在良、恶性前列腺细胞TGFβ分泌差异中的作用；(3)探讨在良、恶性前列腺细胞中TGFβ自身诱导差异的机制。
　　 方法：(1)用酶联免疫吸附(ELISA)测定前列腺恶性肿瘤PC3、DU145，良性前列腺增生BPH1和正常前列腺上皮细胞RWPE1等四种不同细胞株上TGFβ分泌水平的差别；(2)通过用TGFβ中和受体1D11，或者将四种细胞系转染包含TGFβ竞争性抑制受体的逆病毒来阻断内源性TGFβ，然后再测量这四种细胞株的TGFβ分泌水平，从而判断内源性TGFβ对其自身水平维持的作用；(3)用不同剂量外源性TGFβ(低剂量0.1ng/ml；高剂量10ng/ml)刺激这四种细胞株，用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测诱导的内源性TGFβ转录水平，从而判断外源性TGFβ对维持内源性TGFβ水平的作用；(4)用Western-blot检测四种细胞株给予外源性TGFβ刺激后，胞外信号调节激酶(ERK)活化水平的变化，用U0126阻断ERK后，观察四种细胞株中TGFβ自身诱导的变化；(5)测量四种细胞株给予不同剂量TGFβ诱导后，酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PPP)活性的变化；(6)用免疫共沉淀(co-IP)检测不同细胞株给予TGFβ刺激后TGFβ受体I(TBRI)和蛋白酶2A(PP2A)结合量的变化。用冈田酸(OA)抑制PP2A活性后，观察给予不同剂量外源性TGFβ，ERK及内源性TGFβ mRNA水平的变化。
　　 结果：(1)前列腺肿瘤细胞分泌的TGFβ比正常前列腺细胞高；(2)阻断内源性TGFβ后，在前列腺良性细胞TGFβ转录水平无明显变化，恶性细胞系中TGF B转录水平降低；(3)低剂量的外源性TGFβ，能够在四种细胞株中诱导内源性TGFβ的产生；但高剂量的TGFβ，只能在前列腺恶性细胞中诱导内源性TGFβ的产生；(4)给予低剂量外源性TGFβ，在四种细胞株中，ERK的活化水平都上升，给予高剂量TGFβ刺激，在恶性前列腺癌细胞中，ERK活化继续上升，但在良性前列腺癌细胞，ERK活化水平下降。阻断ERK通路，在四种细胞株中，TGFβ自身诱导都被阻断；(5)在良性前列腺癌细胞，给予外源性TGFβ刺激，其丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性和TBRI/PP2A结合呈剂量依赖性上升，在恶性前列腺癌细胞中，酶活性保持不变；用OA抑制PP2A活性后，给予不同剂量外源性的TGFβ，ERK活性和内源性TGFβ转录水平都增加。
　　 结论：(1)TGFβ在恶性前列腺上皮细胞中高于恶性前列腺上皮细胞中，这种表达水平的差异部分源于在良、恶性细胞中TGFβ自身诱导的差异，即在恶性良性细胞中TGFβ的自身诱导失控，而良性前列腺细胞中自身诱导只用TGFβ在一定浓度范围内时才存在；(2)在良、恶性前列腺上皮细胞中，TGFβ自身诱导的差异是由于ERK通路的差异；(3)在良、恶性前列腺上皮细胞中ERK通路的差异源于在恶性细胞中PP2A通路的缺失。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写对照表

声明

文献回顾

第一部分不同前列腺细胞株TGFβ表达水平的测量

第二部分内源性、外源性TGFβ对内源性TGFβ转录水平的影响

第三部分前列腺细胞TGFβ表达水平差异机制的研究

研究小结

参考文献

文献大综述：Differential activation of extracellular signal-regulated kinases between benign and malignant cells in response to transforming growth factor beta

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致谢