细胞凋亡在慢病毒介导hVEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植治疗MODS中变化的研究

摘要

多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是重症监护病房患者的最常见死亡原因。严重的感染和感染性休克是其主要诱因。感染所致的脓毒症及非感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)相互作用，构成了一个复杂的网络。目前其发病机制尚不完全明确，临床上尚缺乏满意的治疗措施。随着干/祖细胞研究的不断深入，多器官功能障碍综合征的发病机制研究和临床治疗面临着新的契机。
　　 近年来研究发现：骨髓中有一群能够在生理性或病理性因素的刺激下，动员到外周血并分化为成熟内皮细胞(Endothelium cell，EC)以促进血管新生，并可以分化为相应的组织细胞进行损伤修复的祖细胞，这些细胞被称为内皮祖细胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)。EPC过去被认为是胚胎时期血管新生最主要的细胞，而越来越多的证据显示EPCs也是出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞，并参与心、肝、肺、肾等单个器官障碍时的修复；同时迁徙到损伤部位的EPC还可以对不同的局部刺激(包括缺氧或缺血)作出生理反应，依次释放血管活性物质、生长因子以及参与免疫调节的细胞因子和趋化因子，参与创伤后的炎症反应。
　　 同时研究发现内皮细胞不仅是炎症反应的参与者，还是首先受损的靶细胞，并进而造成微血管损伤、微循环障碍，这可能是器官功能障碍的始发环节。大量的动物和临床实验都已经证明：当组织受到损伤时，尤其是缺血性损伤时，循环及组织中EPCs动员和增殖能力增强，并可以在组织内分化为内皮细胞替换功能障碍的内皮细胞、修补裸露的血管内皮损伤区，并参与缺血或损伤组织内新血管生成，从而改善缺血器官的功能；而如果创伤后EPCs的分化、迁徙功能发生严重障碍，则会导致损伤微循环严重损害而无法得到修复，甚至发生器官功能衰竭。
　　 既往研究发现与MODS有关的细胞因子有白介素(IL-1，IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白(HSP)、糖皮质激素和细菌产物如内毒素等，它们在导致SIRS/MODS细胞凋亡中具有潜在作用。通过对某些重要器官的细胞凋亡机制及其影响因素的研究可以更深入的了解MODS的机理，为临床更好的防治MODS提供实验依据。
　　 本研究通过内毒素+失血性休克制造出MODS的动物模型，在此基础上进行慢病毒介导VEGF-GFP基因转染EPCs移植治疗，动态观察移植前后动物生命体征的变化，血浆中IL-1β、TNF-α等炎性因子表达的变化，以及主要脏器的细胞凋亡情况，评价移植EPC防治MODS的效果，并对其作用机制进行初步探讨。全文共分四部分：
　　 第一部分目的：复制双相迟发型的兔MODS模型，为研究移植内皮祖细胞防治创伤后多器官功能障碍的研究提供实验基础。方法：将体重2.52±0.27Kg健康雄性家兔随机分为2组：实验组(M组)12只，施行失血性休克+内毒素血症复合因素；对照组(C)12只，施行假手术，予以股动静脉置管，不实施失血及内毒素注射。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、动脉血氧分压(PaO2)，以判断器官功能，7天后处死存活动物，观察主要脏器的病理改变。结果：实验组(M组)WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN均明显升高，动物死亡前显著高于正常值，PaO2明显下降。病理学改变主要表现为衰竭器官呈以炎症为主的非特异性改变。实验组MODS发生率为83.3％，死亡率为75％，显著高于对照组。结论：本实验采用二次打击方法，与临床实际相符，并且MODS的发生率及死亡率均高，操作简单，容易复制，是一个较成功的动物模型。
　　 第二部分目的：制备携带hVEGF165-GFPs双表达基因的慢病毒载体，体外转染内皮祖细胞，为EPC移植治疗做准备。方法：将目的基因VEFG165插入慢病毒过表达载体pWPXL-MOD，慢病毒包装质粒转染293T细胞，得到LV/hVEGF165-GFP，将LV/hVEGF165-GFP与EPCs共培养以转染EPCs。对LV/hVEGF165-GFP-EPCs进行其黏附、迁徙、增殖和血管生成功能进行检测。结果：慢病毒载体能表达目的基因VEGF，成功构建和包装了慢病毒载体；并证实EPCs经LV/hVEGF165-GFP转染后转染率达99％。其迁徙、增殖和血管生成等功能较未转染EPCs提高，P＜0.05。结论：LV/hVEGF165-GFP对细胞无毒性，且能提高EPCs的粘附、迁徙及增殖能力。
　　 第三部分目的：研究细胞凋亡在慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染EPCs移植治疗MODS中的变化及意义。方法：将体重2.52±0.27Kg健康雄性家兔随机分为3组：单纯MODS组(M)12只，施行失血性休克+内毒素复合因素；单纯内皮祖细胞移植组(ET)12只和慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染内皮祖细胞移植组(VT)12只，在固定时间点，分别以1×107个细胞/Kg(体重)和1×107个转染后细胞/Kg(体重)的剂量进行移植治疗。用自动分析仪检测WBC、GRAN、SALT、SAST、Cr、BUN、动脉血氧分压(PaO2)，以判断器官功能，7天后处死存活动物，观察主要脏器的病理改变。原位末端(TUNEL)法检测主要脏器细胞凋亡情况。RT-PCR法检测主要脏器caspase3mRNA表达情况。结果：VT组WBC、GRAN、GOT、GPT、Cr、BUN等指标在移植治疗后较M组及ET组均有明显改善，比较有统计学意义。VT组主要脏器细胞凋亡及caspase3mRNA表达均低于M组及ET组，P＜0.01。VT组动物的MODS发生率和死亡率较M组及ET组明显减少，P＜0.05。结论：移植慢病毒介导VEGF165-GFP基因转染EPCs治疗MODS，能减少MODS动物的细胞凋亡，明显的改善各个重要脏器的功能，降低动物的死亡率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 家兔多器官功能障碍动物模型的建立

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分：制备携带hVEGF165-GFP双表达基因慢病毒载体及体外转染内皮祖细胞

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 细胞凋亡在LV/hVEGF165-GFP-EPCs移植治疗MODS中的变化及意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

文献综述 内皮祖细胞应用研究进展

在校期间发表论文

致谢