PAMAM-eIF4E-shRNA纳米微粒对人肝癌细胞抑制作用实验研究

摘要

研究背景及目的:
　　 原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后很差，发现时多属晚期，五年生存率较低，目前的放化疗及手术均效果不佳，探索新的肝癌治疗手段具有重要价值。
　　 真核翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)在真核细胞翻译起始阶段有重要作用。该家族的eIF4E可特异性地与mRNA5'帽子结构(m7GpppN)结合并调节mRNA翻译表达，高表达于多种实体肿瘤细胞(如头颈部鳞癌、喉癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、胆管癌、结肠癌等)，其高表达水平与肿瘤的发生、浸润、转移密切相关[1]。
　　 小分子干扰RNA(small interferencing RNA，siRNA)具有特异、高效沉默靶基因的特点，有望成为肿瘤治疗最有前景的特异性基因药物[2]。
　　 PAMAM-Dendrimer(聚酰胺-胺型树枝状分子，PAMAM-D)是一种新型纳米载体，呈树枝状结构，其外层端基-NH2可质子化成为-NH3+，表面携带正电荷，能与天然状态下存在的带负电荷的生物活性物质发生静电相互作用，形成复合物。具有携带量大、携带力强、透过细胞膜能力更强、缓释性更好、对人体毒性更小等多方面的优点，比以往采用的PLGA等纳米载体更有优势[3]。
　　 本研究在体外设计合成针对eIF4E基因的短发夹RNA(shRNA)，筛选出沉默该基因表达的有效片断，利用对人体毒性较小的新型纳米载体聚酰胺-胺型树状高聚物PAMAM-D携带该shRNA分子，并将其导入细胞。在人肝癌细胞水平观察该纳米载体介导的针对eIF4E的shRNA(PAMAM-eIF4E-shRNA纳米微粒)对肝癌细胞eIF4E基因表达的影响，及其对肝癌细胞的抑制作用，为开发新的抗肝癌基因药物提供思路。
　　 实验方法：
　　 一、检测eIF4E在肝肿瘤细胞和人肝癌组织中的差异表达
　　 Western Blot法检测人正常成熟肝细胞、人肝肿瘤细胞株HepG2、Hep3B、Huh7中eIF4E蛋白的表达情况。免疫组织化学法检测46组人肝癌组织及其癌旁组织中eIF4E的蛋白表达水平。
　　 二、构建针对eIF4E的PAMAM-eIF4E-shRNA载体复合物
　　 用RNAi设计软件，从人eIF4E mRNA编码区(GenBankNMBC035166)的起始密码子(AUG)下游寻找两条以“AA”开始的二联序列，设计合成长度为2Ints的两条序列，并设计一对非特异性序列作为对照，与人类基因组进行BLAST比对，验证其均为单一基因。合成以上寡核苷酸DNA单链，然后退火连接形成双链shRNA。
　　 室温下，不含血清的RPMI1640培养液中，分别加入shRNA和PAMAM-D载体、shRNA和脂质体，混合反应后，分别得到PAMAM-shRNA和脂质体-shRNA复合物。
　　 三、针对eIF4E的PAMAM-D-shRNA载体复合物转染肝癌细胞，检测下调eIF4E表达对肝肿瘤细胞生物学特性(增殖和凋亡)的影响
　　 1、细胞培养
　　 37℃，5％CO2，将脂质体-shRNA和PAMAM-shRNA复合物分别与肝癌细胞共育。
　　 2、Real Time PCR法检测eIF4E mRNA表达
　　 抽提细胞RNA，逆转录反应制备eDNA，然后进行Real Time PCR扩增，在图像分析仪上对RT-PCR结果采用仪器自带软件ABI Prism7300 SDS Software进行图像分析。
　　 3、噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力
　　 接种细胞，待细胞贴壁后分为两组，分别加入脂质体-shRNA和PAMAM-eIF4E-shRNA。实验时每孔加MTT20ul，作用四小时。分别于加入shRNA后第1，2，3，4，5，6，7天进行MTT实验。细胞相对抑制率(％)=(1-实验组OD/对照组OD)×100％。
　　 4、流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率
　　 利用P1检测细胞周期，用TUNEL法进行细胞凋亡率的流式细胞仪分析。
　　 四、统计学处理
　　 数据采用SPSS16.0统计学软件进行处理，结果用x±SD表示。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为具有显著性差异。
　　 实验结果:
　　 一、eIF4E在肝肿瘤细胞株和肝癌组织中的表达较癌旁组织和正常肝组织的表达高
　　 1、Westem Blot法检测人正常成熟肝细胞、不同人肝肿瘤细胞株eIF4E基因表达，显示各肝癌细胞株均有eIF4E蛋白的高表达，尤其在HepG2细胞株中表达水平最高。正常细胞L02也有eIF4E蛋白表达，但水平较低。
　　 2、免疫组织化学法检测病理组织蜡块46组，其中32组人肝癌组织eIF4E蛋白表达水平较癌旁组织高，6组无明显差异，8组人肝癌组织中eIF4E蛋白表达水平较癌旁组织低。
　　 二、成功构建针对eIF4E的PAMAM-D-shRNA载体复合物
　　 根据shRNA设计原则，合成特异性DNA片段。然后退火，合成转录DNA模板，转录，纯化。将合成的shRNA与PAMAM-D载体以1μg shRNA：0.65μg PAMAM-D的比例共育，两者通过静电作用结合，形成PAMAM-eIF4E-shRNA载体复合物。
　　 三、下调eIF4E表达抑制肝肿瘤细胞增殖
　　 1、Real Time PCR法检测eIF4E mRNA表达
　　 同样的条件下，PAMAM-eIF4E-shRNA组对肝癌细胞HepG2的eIF4E基因表达水平下调作用更强，推测PAMAM-D作为shRNA的载体具有更高的转染效率。
　　 2、噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力
　　 MTT实验的第1，2，3，4，5，6，7天，P均＜0.05，表示差异有有统计学意义，PAMAM-eIF4E-shRNA组对肝癌细胞有更高的抑制率。
　　 3、PI检测细胞周期
　　 S期，PAMAM-D介导组的细胞凋亡率较脂质体介导组明显增高，PAMAM-eIF4E-shRNA对肝癌细胞有更高的抑制率。
　　 4、凋亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析
　　 TUNEL法检测细胞，PAMAM-eIF4E-shRNA组细胞凋亡指数高于脂质体组。P为0.013，P＜0.05，表示差异有统计学意义。
　　 结论:
　　 1、在HepG2等肝癌细胞株及大部分人肝癌组织中，eIF4E表达水平明显增高。
　　 2、PAMAM-D作为载体，在shRNA携带能力上优于脂质体。
　　 3、针对eIF4E的shRNA转染肝癌细胞后，可下调eIF4E基因的表达水平，并促进肿瘤细胞凋亡。
　　 4、eIF4E有望成为肝癌分子生物学治疗的靶点。PAMAM-D有望成为运送shRNA更高效更安全的新型载体。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

前言

第一部分 检测成熟人肝细胞及不同肝肿瘤细胞、肝癌及癌旁组织真核翻译起始因子4E差异表达

材料与方法

结果

讨论

第二部分 设计针对eIF4E的shRNA，构建PAMAM-D-shRNA表达载体复合物

材料与方法

结果

讨论

第三部分 PAMAM-eIF4E-shRNA复合物转染细胞，检测elF4E在mRNA水平和蛋白水平的表达变化，及细胞凋亡检测

材料与方法

结果

讨论

全文结论

参考文献

综述 eIF4E与肿瘤

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