银杏内生真菌多样性及其活性研究

摘要

内生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史中某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的真菌，包括营表生的腐生真菌和对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根菌。近年来的研究发现，植物内生真菌次生代谢产物具有抗真菌、抗肿瘤和抗氧化等作用，同时与宿主植物有一定的共生进化关系。这与植物内生真菌能够产生结构新颖的天然产物，甚至可以产生与宿主植物相同或相似的代谢产物有很大的相关性，因而对植物内生真菌的研究是寻找植物与内生真菌的协同进化关系，同时又是一个寻找新天然产物的重要途径。
　　 本课题以雌雄异株的药用植物银杏（Ginkgo biloba L.）为研究材料，对其内生真菌的定殖率、种类组成、内生真菌活性菌株的筛选及内生真菌菌株目标次生代谢产物的寻找方法等方面进行研究。取得如下结果：
　　 采用三步消毒法比较不同的次氯酸钠表面消毒时间对内生真菌分离的影响，最终确定最佳消毒条件。叶片的最佳消毒条件为：75％乙醇1 min，3％次氯酸钠1 min，75％乙醇0.5 min；75％乙醇1 min，5％次氯酸钠3 min，75％乙醇0.5 min；银杏树皮最佳消毒条件为：75％乙醇1 min，5％次氯酸钠5 min，75％乙醇0.5 min。
　　 银杏内生真菌具有较丰富的物种多样性。从天目山和建德地区分别分离得到440株和382株内生真菌。分别属于9目、14科、19属、28种和8目、10科、11属、26种。天目山地区内生真菌优势属为Fusarium、Phomopsis、Alternaria、Bjerkandera、Phoma五个属，建德地区的内生真菌优势属为Fusarium、Phomopsis、Diaporthe、Mucor、Pestalotiopsis五个属，两地共有的优势菌为Fusarium和Phomopsis两个属。
　　 从天目山采集的雌雄各20株银杏的枝条及树皮中共分离获得805株内生真菌菌株。其中，雄株银杏分离得到内生真菌416株，雌株银杏分离得到内生真菌389株，雄株内生真菌在定殖率和菌株个数上均高于雌株。通过比较雌、雄株银杏中分离得到的内生真菌发现如下特点：805个内生真菌菌株中，Thichodermaatroviride和Leptosphaeria microscopica的分离频率较高并且仅在雄株枝条上分离得到。从雄株上分离得到的Fusarium tricinctum明显多于雌株，而从雌株上分离得到的Phomopsis fukushii明显多于雄株。原因可能是由于雌株由于化学成分的不同会对内生真菌的生长和分布产生了一定的影响。
　　 根据形态鉴定的结果及对不产孢菌株形态型的划分结果，选取56个银杏内生真菌的代表菌株对其发酵产物进行抗真菌及抗氧化活性的筛选。结果表明菌株发酵产物的乙酸乙酯部位优于水部位；共计9株（16.1％）内生真菌发酵产物的乙酸乙酯提取物具有较好的抗白色念珠菌（Candida albicans）、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）以及薰烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）活性。其中，以从银杏树皮中分离得到的青霉属T-1-2-1菌株发酵产物乙酸乙酯提取物的抗真菌活性最佳；采用DPPH法测定银杏内生真菌抗氧化活性，结果表明共计5株（8.9％）内生真菌的抗氧化活性较好，其中，以毛壳属T-3-2-2、炭角菌属T-6-5-7菌株的抗氧化活性最好。以上结果表明，银杏内生真菌发酵产物具有良好的生物活性，有必要对其进行深入研究，以期从中发现结构新颖、活性较好的天然产物。
　　 采用分子生物学方法寻找银杏内生真菌中与植物宿主银杏产生相同化学成分的菌株。提取121株银杏内生真菌基因组DNA，设计引物，对目标化合物合成途径中4个关键酶基因进行克隆，并未发现特异性目标条带。虽然未找到能够产目标关键酶的菌株，但为今后筛选产目标化合物菌株在分子生物学方面提供了思路。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

前言

第一章 银杏内生真菌分离方法的确立

1.1 材料、仪器及试剂

1.2 方法

1.3 结果与讨论

第二章 银杏内生真菌的分离、纯化及鉴定

2.1 材料、仪器及试剂

2.2 方法

2.3 结果与讨论

第三章 银杏内生真菌多样性分析

3.1 材料、仪器及试剂

3.2 方法

3.3 结果与讨论

第四章 银杏内生真菌活性菌株的筛选

4.1 活性菌株的筛选

4.1.1 材料、仪器及试剂

4.1.2 方法

4.1.3 结果与讨论

4.2 活性菌株与宿主醚溶成分的比较研究

4.2.1 材料、仪器及试剂

4.2.2 方法

4.2.3 结果与讨论

第五章 内生真菌产与宿主相同成分探索

5.1 材料、仪器及试剂

5.2 方法

5.3 结果与讨论

第六章 总结与讨论

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

综述 药用植物内生真菌研究进展

参考文献

致谢

附录一 部分银杏内生真菌菌种照片

附录二 英文已发表文章