Nogo-B在LPS诱导的小鼠急性肺损伤中的保护性作用及其可能机制

摘要

背景：内毒素（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤（Acute lung injury, ALI）
　　 本质上是一种由巨噬细胞启动，中性粒细胞过度激活导致的自我放大和失控的持续性肺部炎症损伤。巨噬细胞在急性肺损伤的病程中，发挥始动者及决定病情未来走向的作用。炎症环境下，巨噬细胞的黏附、迁移、分泌等能力是实现其生物学功能的关键，然而目前对于ALI 发生、发展过程中巨噬细胞上述募集相关功能的调控机制，尚不明确。Nogo-B是网状蛋白家族4 （reticulon peotein family, Rtn4）中的重要成员，其参与了细胞凋亡、迁移、粘附等细胞生物学过程，从而在组织损伤后修复、神经退行性病变等病理生理过程中发挥了重要作用。最新研究显示，Nogo-B 参与了缺血后组织损伤修复过程，其主要通过调控巨噬细胞的粘附和迁移而实现。在内毒素诱导的ALI 发生、发展过程中，Nogo-B是否同样对巨噬细胞的募集存在调控，并通过这一机制而参与ALI的发生、发展过程，目前尚未见报道。
　　 目的：明确Nogo-B在 ALI 发生、发展过程中的可能作用，并初步探讨Nogo-B是否通过调控巨噬细胞功能发挥其在ALI 发生、发展过程中的作用。
　　 方法：：一、LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型构建及Nogo-B表达变化
　　 （一）选择野生型雄性C57BL/6小鼠，通过LPS （O0111:B4，15mg/kg）气管滴注的方法复制ALI小鼠模型。
　　 （二）采用HE 染色、Evans blue 示踪、BCA蛋白浓度测定、流式细胞计数、ELISA等方法分别检测小鼠肺组织病理、肺泡-毛细血管通透性、炎症细胞及炎症因子浓度的改变。
　　 （三）采用免疫组化、免疫荧光、Western blot等方法检测肺组织及肺泡巨噬细胞(Alveolar macrophage, AM)中Nogo-B表达水平的变化。
　　 二、Nogo-B 高表达腺病毒载体的构建及其表达验证
　　 （一）化学合成小鼠Nogo-B基因，采用EcoR Ⅰ酶将穿梭质粒Pav-MCMV-RFP-3FLAG 酶切线性化后，通过同源重组的方法将Nogo-B 连接至穿梭质粒载体。测序鉴定无误后，与辅助包装质粒Phg lox E1,3 Cre △经脂质体共转染HEK293细胞，在HEK293细胞中同源重组并包装成重组腺病毒（Ad-Nogo-B）。
　　 （二）将Ad-Nogo-B及阴性对照腺病毒（Ad-RFP）感染RAW264.7细胞，荧光显微镜下观察细胞RFP表达情况，并通过Western blot 法检测Nogo-B-RFP-3FLAG融合蛋白表达水平。
　　 三、Nogo-B在LPS 诱导构建的小鼠急性肺损伤中的保护性作用
　　 （一）选用野生型雄性C57BL/6小鼠，采用颈外静脉注射的方法构建Nogo-B高表达小鼠。
　　 （二）使用致死剂量（25mg/kg）的LPS 复制ALI小鼠模型，记录造模后小鼠生存时间，以观察上调Nogo-B对ALI小鼠模型生存率的影响。
　　 （三）使用正常剂量（15mg/kg）的LPS 复制ALI小鼠模型，通过HE 染色、Evans blue 示踪、BCA蛋白浓度测定、流式细胞计数、ELISA等方法，分别观察上调Nogo-B表达对小鼠肺组织损伤及炎症程度的影响。
　　 四、Nogo-B对巨噬细胞募集相关功能的影响
　　 （一）选择体外培养的RAW264.7细胞株，以不同浓度的LPS与细胞分别共培养12 h 或24 h后，采用Western blot方法检测Nogo-B的表达水平变化。
　　 （二）采用腺病毒转染的方法上调细胞Nogo-B的表达水平后，分别采用黏附实验、Transwell 法及ELISA 法检测上调Nogo-B表达对LPS 诱导的RAW264.7细胞黏附、迁移及炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌的影响。
　　 结果：一、LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型构建及Nogo-B表达变化
　　 （一）与PBS对照组比，LPS 诱导12 h后，小鼠肺脏呈现出血、渗出、肺泡间隔增厚、肺透明栓形成等典型ALI表现，伴有肺微血管渗透性(0.506±0.105vs.0.257±0.054, n=5）及肺泡蛋白渗出显著增高 （1002.65±253.878vs. 567.24±220.611ug/ml, n=5)。同时，LPS 模型组BALF中，炎症细胞总数增加(3.72±1.321vs.2.09±0.15, n=3）、TNF-α（819.21±264.125vs. 260.63±173.08 pg/ml, n=4)、IL-1β(112.82±20.403vs. 31.58±15.962 pg/ml, n=4)、MCP-1(75.09±4.548vs. 55.18±3.818 pg/ml, n=4）等炎症因子浓度显著升高（P 均<0.05）。
　　 （二）LPS 模型组小鼠肺组织及AM中Nogo-B表达水平较对照组显著降低。Western blot 结果显示LPS 模型组小鼠肺组织较对照组下降约5.06倍(Nogo-B/GAPDH灰度扫描：0.91±0.154vs. 0.18±0.091, n=5， P＜0.05)。
　　 二、Nogo-B 高表达腺病毒载体的构建及其表达验证
　　 （一）重组质粒Pav-MCMV-Nogo-B-RFP-3FLAG构建成功。
　　 （二）与辅助包装质粒Phg lox E1,3 Cre △共转染HEK293细胞后，出现明显的毒斑。病毒原液浓缩、纯化后，病毒滴度为1×1011pfu/ml。
　　 （三）重组病毒Ad-Nogo-B 感染RAW264.7细胞72h后，含Nogo-B-RFP-3FLAG融合蛋白在细胞胞浆高表达。
　　 三、Nogo-B在LPS 诱导构建的小鼠急性肺损伤中的保护性作用
　　 （一）Nogo-B 腺病毒转染有效上调了肺组织Nogo-B的表达水平。
　　 （二）与阴性腺病毒转染组比，Nogo-B 腺病毒转染小鼠在LPS 诱导后生存时间显著延长（28.7±10.78vs. 16.9±4.85 h, n=8, P＜0.05）。
　　 （三）与阴性腺病毒转染组比，HE 结果提示Ad-Nogo-B 转染组肺组织损伤程度减轻，Evans blue 结果显示肺微血管通透性（29.98±6.028vs. 54.37±8.774, n=5）降低，肺泡蛋白渗出（1032.9±64.47vs. 1859.2±359.76 ug/ml, n=5）减少。同时，BALF中巨噬细胞数目增加（3.65±0.862vs. 2.36±0.618×105， n=5），伴MCP-1（121.17±16.547vs. 97.67±11.68 pg/ml, n=4）水平升高，且IL-1β（282.87±75.423vs. 505.6±165.3 pg/ml, n=4）水平降低（P 均<0.05），但TNF-α（1043.94±157.12vs.
　　 959.73±143.769 pg/ml, n=4, P＞0.05）分泌水平两组无明显差异。
　　 四、Nogo-B对巨噬细胞募集相关功能的影响（一）LPS作用12 h及24 h后，RAW264.7细胞中Nogo-B表达随LPS浓度增高而显著降低。
　　 （二）Nogo-B 腺病毒转染后，RAW264.7细胞的MCP-1表达水平在LPS作用后12 h 显著高于阴性腺病毒转染组(12h：36.69±20.1vs. 624.63±19.158 pg/ml, n=6;24h：785.12±18.053vs. 577.4±48.634 pg/ml, n=3; 48h：626.2±35.29vs. 459.57±26.453 pg/ml, n=3，P 均<0.05)，但两组细胞在黏附、迁移及TNF-α、IL-1β分泌水平上无明显差异。
　　 小结：一、采用LPS 诱导的方法，可成功复制ALI小鼠模型。ALI小鼠肺组织及AM中Nogo-B表达显著降低，提示Nogo-B 极有可能参与了ALI的发生、发展过程。
　　 二、成功构建出在RAW264.7细胞中高表达Nogo-B蛋白的重组腺病毒。
　　 三、Nogo-B在LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中发挥了保护性作用，该作用可能通过上调MCP-1分泌水平，促进肺泡巨噬细胞向肺部募集而实现。
　　 四、RAW264.7细胞中的Nogo-B蛋白在LPS作用下表达降低，恢复其表达有利于促进细胞的MCP-1分泌。
　　 结论：Nogo-B 可能通过上调MCP-1表达水平，促进肺泡巨噬细胞募集而在LPS 诱导的急性肺损伤中发挥保护性作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一部分：LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型构建及Nogo-B表达变化

第二部分：Nogo-B高表达腺病毒载体的构建及其验证

第三部分：Nogo-B在LPS诱导的小鼠急性肺损伤中的保护性作用

第四部分：Nogo-B在巨噬细胞募集相关功能调控中的作用

参考文献

综述Nogo-B的生物学功能

附录

致谢