Obestatin对大鼠胰腺外分泌调节作用的实验研究

摘要

Obestatin(肥胖抑制素)是最近从大鼠胃组织中发现的一种新的脑肠肽。它是一种ghrelin 相关肽，与ghrelin 来自同一基因。Obestatin与ghrelin在调节摄食、胃肠生理等方面作用完全相反，被认为是一对“阴阳”肽。Ghrelin 也称为食欲刺激素，是一种由23个氨基酸组成的脑肠肽，生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）为其受体，ghrelin对胰腺外分泌也具有重要的调节作用，主要表现为促进胰腺外分泌，其机制是通过迷走-迷走神经通路发挥作用的。虽然obestatin和ghrelin 来源于同一前体proghrelin，但obestatin 自发现以来就充满了各种争议，2005年，Zhang等首先在胃黏膜中发现并命名了obestatin，在最初的功能研究中，腹腔和侧脑室注射人源性obestatin 可以抑制大鼠的食欲，减少体重，进一步的研究发现：obestatin 可以抑制渴感和焦虑、提高大鼠的记忆力、抑制前脂肪细胞的增长、控制机体的水代谢。在人体的研究当中，部分研究者发现在肥胖人群里，胃黏膜中obestatin表达量和血循环中obestatin 含量均出现减少，因此他们推测obestatin在调节机体能量代谢方面发挥了重要作用，是ghrelin的拮抗剂。尽管有以上证据证明obestatin 存在生物学作用，但绝大多数研究应用了大剂量范围的obestatin、不同的实验方法、不同的动物及不同来源的obestatin 并未得出相同结论，因此有研究者提出应该重新命名obestatin。除了对obestatin 生物学功能方面存在疑问外，对其受体也存在着争论：其发现者首次报道了G蛋白偶联受体39（GPR39）
　　 是obestatin的天然受体，结合实验也证明GPR39 广泛存在于中枢神经系统、外周重要器官，而以胃肠道的含量最高。后来的三个实验室并未证明GPR39为obestatin的固有受体，因此对发现者的研究提出了质疑，对于以上质疑，2007年Zhang 重复了自己的实验并得出他们实验室不能证明GPR39是obestatin 受体的结论。因此对obestatin的研究还存在以下疑问：(1)在obestatin 本身方面：在体内这种分子是否真正存在?如果存在到底有怎样的生理功能功能?是否能拮抗ghrelin的生理作用?它是否受到中枢及其他激素的调控?(2)在外源性分子方面：
　　 人工合成的外源性obestatin 多肽分子是否具有与内源性分子相同的空间结构及生物活性?(3)在obestatin 受体方面：obestatin是否通过GPR39 受体发挥作用？是否还有别的作用途径?(4)在研究方法方面：利用人工合成的obestatin抗体，检测到的仅仅是obestatin，还是包括了无实际作用的preproghrelin 或proghrelin？
　　 胰腺的外分泌功能受到中枢神经和肠神经以及大量的激素和脑肠肽组成的复杂网络的调节，业已证实：胆囊收缩素（CCK）、促胰液素、胰多肽、ghrelin、血管活性多肽、蛙皮素和胃动素等激素可以刺激胰腺的外分泌；而生长抑素、胰高糖素、降钙素、肾上腺素和去甲肾上腺素等可以抑制胰腺的外分泌，由于对obestatin 功能及受体研究存在着大量的争论，并且obestatin对胰腺外分泌功能的调节作用目前还不清楚。本研究拟采用大鼠离体腺泡、小叶及在体胰腺外分泌功能研究模型，应用分离大鼠离体腺泡细胞和胰腺小叶、静脉持续注射、侧脑室内微量注射等技术明确obestatin对胰腺外分泌功能的调节作用及其机制，并观察obestatin及其它脑肠肽对大鼠胰腺外分泌调节的交互作用，用胆囊收缩素作为阳性对照，从而进一步完善胰腺外分泌调节的机制和obestatin的生物学功能。
　　 第一部分一种改良的胰腺腺泡提取方法一种改良的胰腺腺泡提取方法一种改良的胰腺腺泡提取方法一种改良的胰腺腺泡提取方法目的：对经典的Williams 提取胰腺腺泡方法进行改良，以期探索一种简便，经济和稳定的胰腺腺泡分离纯化的新方法。
　　 结论：我们认为本实验室采用的改进方法是一种简便，经济和稳定的腺泡分离纯化方法。
　　 第二部分Obestatin Obestatin Obestatin Obestatin对大鼠胰腺腺泡对大鼠胰腺腺泡对大鼠胰腺腺泡对大鼠胰腺腺泡////小叶淀粉酶影响小叶淀粉酶影响小叶淀粉酶影响小叶淀粉酶影响目的：研究不同剂量肥胖抑制素对大鼠离体胰腺腺泡及胰腺小叶淀粉酶分泌的影响。
　　 结论：体外实验中，外源性obestatin对大鼠胰腺腺泡及胰腺小叶淀粉酶分泌无影响，obestatin对活体大鼠胰腺外分泌影响需要进一步研究。
　　 第三部分静脉注射静脉注射静脉注射静脉注射obestatin obestatin obestatin obestatin对大鼠胰腺外分泌的影响对大鼠胰腺外分泌的影响对大鼠胰腺外分泌的影响对大鼠胰腺外分泌的影响目的：采用静脉持续注射的方法研究不同剂量肥胖抑制素对大鼠胰腺外分泌功能的影响。
　　 结论：外周静脉给予CCK-8 可增加胰液和胰液蛋白的分泌，静脉注射obestatin对胰腺外分泌功能无影响，并且不能改变由CCK-8 引起的胰液和胰液蛋白的增高。
　　 第四部分第四部分第四部分第四部分脑室微量注射脑室微量注射脑室微量注射脑室微量注射obestatin obestatin obestatin obestatin对大鼠胰腺外分泌的影对大鼠胰腺外分泌的影对大鼠胰腺外分泌的影对大鼠胰腺外分泌的影响响响响目的采用侧脑室微量注射的方法研究肥胖抑制素对大鼠胰腺外分泌功能的影响。
　　 结论外周静脉给予CCK-8 增加胰液和胰液蛋白的分泌，侧脑室微量注射obestatin对胰腺外分泌功能无影响，并且不能改变由CCK-8 引起的胰液和胰液蛋白的增高。
　　 第五部分第五部分第五部分第五部分十二指肠内灌注十二指肠内灌注十二指肠内灌注十二指肠内灌注obestatin obestatin obestatin obestatin对大鼠胰腺外分泌影对大鼠胰腺外分泌影对大鼠胰腺外分泌影对大鼠胰腺外分泌影响的初步研究响的初步研究响的初步研究响的初步研究目的：采用十二指肠内持续灌注的方法研究不同剂量obestatin对大鼠胰腺外分泌功能的影响方法：SD大鼠14只，随机分成2组，麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3％戊巴比妥钠（15mg/kg）腹腔内麻醉，麻醉成功后固定于操作板上，放于75％酒精内消毒30分钟，在上腹部打开腹腔，于胃及十二指肠之间找到胰管及十二指肠乳头，经十二指肠乳头对侧肠管插入聚乙烯导管（PE-10）约0.5cm，十二指肠乳头上端插入PE-10以微泵灌注obestaTin及回输胆胰混合液（P-BJ）。
　　 模型稳定30分钟后开始实验，每15分钟经胰管插管收集一次P-BJ 测定体积，并留取50ul 测定蛋白含量，剩余P-BJ 经由十二指肠回输。所有大鼠于实验开始后15分钟收集一次P-BJ作为基础分泌。B组于实验开始15分钟后分别给予十二指肠内微泵灌注5nmolkg-1h-1obestatin 105分钟,A组除了不做十二指肠灌注以外，其余处理均同B组。
　　 结论十二指肠内持续灌注obestatin对大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白无影响。
　　 全文小结：本课题通过采用①建立离体大鼠胰腺腺泡细胞及胰腺小叶，分别与不同浓度的obestatin及腺泡刺激剂(CCK-8)和胰腺小叶刺激剂（KCL）进行共培养，观察细胞内外淀粉酶水平的变化，进而分析obestatin对胰腺外分泌功能的影响；②建立活体麻醉大鼠胰腺外分泌动物模型，静脉给予不同浓度的obestatin 观察其对胰腺外分泌量及胰液蛋白的影响；并与胰腺刺激剂CCK-8 共同注射，观察其是否与CCK-8 存在协同或拮抗作用。③建立麻醉大鼠胰腺外分泌模型，通过侧脑室微量注射obestatin，观察其是否能通过中枢神经影响大鼠胰腺外分泌功能。④通过十二指肠内灌注的方法观察obestatin对大鼠胰腺外分泌功能的影响，结果显示：体外实验中，外源性obestatin对大鼠胰腺腺泡及胰腺小叶淀粉酶分泌无影响，外周静脉给予CCK-8 可增加胰液和胰液蛋白的分泌；在麻醉大鼠中，静脉给予obestatin对胰腺外分泌功能无影响，并且不能改变由CCK-8 引起的胰液和胰液蛋白的增高。脑室内微量注射obestatin对胰腺外分泌功能无影响，并且不能改变由CCK-8 引起的胰液和胰液蛋白的增高。单独十二指肠内灌注obestatin对大鼠胰腺外分泌功能无影响。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略词表英文缩略词表英文缩略词表英文缩略词表

声明

前言

第一部分一种改良的胰腺腺泡提取方法

第二部分Obestatin 对大鼠胰腺腺泡/小叶淀粉酶影

第三部分静脉注射obestatin对大鼠胰腺外分泌的影响

第四部分侧脑室微量注射obestatin对大鼠胰腺外分泌功能的影响

第五部分十二指肠内灌注obestatin对大鼠胰腺外分泌影响的初步研究

综述胰腺外分泌功能的神经及脑肠肽调节

科研经历

致谢