血浆髓过氧化物酶双抗体夹心光激化学发光方法的建立和临床初步应用

摘要

在发达国家冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）居于死亡原因的首位。中国冠心病的发病率和死亡率虽然较发达国家低，但是随着社会和经济的发展，亦逐年上升；已成为我国成人死亡的重要原因。急性冠状动脉综合征（acute coronarysyndrome，ACS)是冠状动脉易损斑块破裂或血栓形成导致的严重心肌缺血事件，占冠心病病人总数的30％～40％，是近年心血管疾病研究的热点。ACS 包括不稳定型心绞痛、非ST 段抬高型心肌梗死和ST 段抬高型心肌梗死。现有研究认为，炎症反应和易损斑块破裂互为因果，并启动了ACS 病理生理机制的一个恶性循环过程。在此基础上继发血栓形成，导致了临床上的ACS。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO) 具有促炎、促动脉粥样硬化的作用，影响粥样斑块的稳定性，并通过增强氧化应激和氧化修饰等作用促进动脉粥样硬化的形成，参与了动脉粥样斑块发展的演变过程。MPO作为一种新的预测ACS的炎症标志物，其表达和活性升高是ACS 发生的原因。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary interventions，PCI)是目前治疗冠心病的一种有效手段，但再狭窄是制约这一技术应用的主要问题。支架置入对狭窄血管的作用是一种“有控制的损伤”。对损伤的修复过程是支架置入后一种普遍存在的、基本的血管反应，涉及到局部炎症反应、多种细胞因子和生长因子介导的局部血管重建和再塑以及血管平滑肌细胞迁移、增殖、凋亡等诸多环节。如何防止PCI术后冠状动脉再狭窄一直是全球心血管医师讨论的热点话题。该课题研究的重点是建立检测血浆MPO的双抗体夹心光激化学发光免疫法，进行了方法学验证。在此基础上应用所建的方法对ACS患者冠脉支架置入前后血浆MPO的水平变化进行评估。
　　 目的：建立一种定量检测血浆中MPO浓度的双抗体夹心光激化学发光免疫检测法（LiCA），用于心血管疾病的辅助诊断；分别观察冠脉造影前后和冠脉支架置入前后患者血浆MPO、hs-CRP、IL-6、cTnI水平及WBC 计数等的变化，进一步探讨关于冠脉支架置入后患者血中相关炎症因子水平变化的临床意义。
　　 方法：采用棋盘格滴定法，从针对MPO抗原的12种单克隆抗体（McAbs）中筛选出最佳双抗体组合（一种McAb 包被发光微粒，另一种McAb 进行生物素化），进而确定双抗体最适反应浓度及MPO-LiCA的最适反应条件，建立标准曲线，评价该法的敏感性、可重复性以及回收率等指标，并与经典的CardioMPO 酶联免疫吸附法进行平行比较分析。对冠脉造影前后和冠脉支架置入前后的临床资料进行比较分析，包括：性别、年龄以及MPO、cTnI、hs-CRP、IL-6、WBC 计数、肌酐、尿酸、血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、同型半胱氨酸等的水平（血浆MPO 采用CardioMPO 酶联免疫法检测所得，其它指标均经第二军医大学附属长海医院实验诊断科检测获得）。研究中采用SPSS16.0软件和EXCEL 进行统计分析。
　　 结果：筛选到两种最适McAbs，并与链霉亲和素包被的感光微粒连接，成功建立了MPO定量检测的LiCA 方法。该法检测的敏感性为1.76 ng/ml，在5～500ng/ml范围内线性良好。批内变异系数和天批间变异系数分别为2.73％和3.76％，平均回收率102.5％，MPO浓度高达800ng/ml时无Hook 效应。80份临床冠脉支架置入术前后患者血浆MPO的测定结果与CardioMPO 酶联免疫法比较具有良好的相关性（r=0.961）。冠脉造影前后病人血浆MPO水平的差异无统计学意义（P=0.454），hs-CRP和IL-6水平差异有统计学意义（分别为：P<0.001，P=0.013），造影后显著升高。冠脉支架置入术前后患者血浆MPO、hs-CR和IL-6水平差异均有统计学意义（分别为：P<0.001，P<0.001，P=0.018），支架置入术后显著高于支架置入术前。
　　 结论：成功建立了一种MPO 定量检测的LiCA 新方法，与CardioMPO 酶联免疫法相比，该法具有更高的敏感性、特异性和稳定性，且测定范围更宽, 试剂寿命更长，操作流程简便，耗时较短，在心血管疾病的辅助诊断中具有极好的应用前景。MPO在冠状动脉支架置入术后24小时内水平升高，而冠脉造影组中MPO水平无变化，表明：MPO在冠状动脉支架置入术后表达增加是由于支架置入引起的冠状动脉血管损伤触发多形核白细胞的聚集和局部的炎症反应所致，与超敏C 反应蛋白和白细胞介素6联合观察，为临床冠心病检测治疗提供了新思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词

声明

前 言

第一部分 MPO 双抗体夹心光激化学发光免疫测定法的建立

第二部分 冠状动脉支架置入后相关炎症因子的变化及其临床意义

参考文献

全文总结

附表12 株单克隆抗体棋盘格滴定法所得光信号值（100 μ g/ml 与4 μ g/ml ）

附综述髓过氧化物酶与冠心病

在读期间发表论文情况说明

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