酪氨酸磷酸酶SHP-1在肾脏缺血再灌注损伤中的作用及其免疫学机制

摘要

器官移植是最为有效的治疗终末期脏器功能衰竭的方法，优质的供体器官是确保移植疗效的先决条件。缺血再灌注（IR）损伤是发生在器官获取和移植过程中的不可避免的病理生理过程，其存在可导致移植物无功能，功能延迟恢复，并增加移植物急、慢性排斥的发病率，降低移植物的中远期存活率。尽管已有多种研究报道声称可以减轻IR损伤，但真正能用于临床治疗的方法尚不多见。IR损伤仍然迫切需要有效的干预措施。IR损伤的病理生理过程涉及线粒体能量合成障碍、钙超载、自由基损伤和细胞凋亡，但更多的研究证明Toll样受体（Toll like receptors, TLRs）所介导的天然免疫反应在IR损伤中发挥关键的作用。TLRs是表达在细胞表面的模式识别受体，除识别来自外源性病原微生物的病原相关分子模式以外，也能被内源性的配体激活。这些内源性的配体被称为危险信号相关分子模式，在机体组织细胞受到损伤之后被释放，包括热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1protein, HMGB1)、双糖链蛋白聚糖（Biglycan）等等。在再灌注早期，氧自由基及脂质过氧化造成缺血组织的直接损伤，大量内源性配体从这些损伤后的组织细胞被释放，通过TLRs受体活化下游信号通路，产生大量的促炎细胞因子和趋化因子，介导IR后天然免疫反应并发挥关键作用。
　　 SHP-1（又名SHPTP-1、SHP、HCP和PTP1C）是一种胞内型的蛋白酪氨酸磷酸酶，主要表达于造血来源的细胞和上皮细胞。SHP-1作为一种负相调节因子参与真核细胞内的各种信号通路，负责控制信号级联反应的削减和终止。前期研究发现SHP-1可以抑制LPS、Poly:IC等外源性TLRs配体启动的活化信号，通过与TLRs信号通路中的白介素-1受体相关激酶1（interleukin-1receptorassociated kinase 1, IRAK1）相互作用，促进I型干扰素的分泌，并通过抑制MAPK和NF-κB的活化，抑制下游促炎细胞因子的产生。SHP-1的这种对于TLRs信号通路的负相调控在缺血再灌注损伤的病理生理背景下具有何种临床意义？在复杂的体内免疫反应过程中，SHP-1参与众多信号通路的调控，整体而言，其介导的负相调控将会产生何种结果？此外，据报道，氧化应激产生的ROS等活性物质对于SHP-1的活性有调控，那么IR后剧烈的氧化应激过程是否会影响SHP-1的表达和/或功能？也就是说，是否SHP-1本来就作为一个元素参与着IR后的炎症反应过程？
　　 鉴于目前针对SHP-1在肾脏IR后病生反应中调控作用的研究尚属空白，亦无肾脏IR对SHP-1表达调控的相关报道，我们在本课题中首先研究了肾脏IR之后SHP-1的表达改变及其可能的调控机制，然后研究了SHP-1对肾脏IR后炎症反应的调节作用及其机制，在此基础上，我们还构建了可供体内转染过表达SHP-1的腺病毒，通过上调SHP-1表达进一步验证了SHP-1对肾脏IR损伤的保护作用。
　　 一、肾脏IR之后SHP-1的表达和活性改变及其调控机制研究
　　 我们首先建立了体外原代培养的小鼠肾小管上皮细胞(TEC)的方法并进行了鉴定；同时参照文献所介绍的方法，建立了体外石蜡油模拟缺血再灌注损伤模型，该模型除适用于小鼠TEC以外，也适用于小鼠腹腔巨噬细胞（M?）等贴壁细胞。通过这一模型，我们发现经过IR之后TEC和M?的SHP-1mRNA和蛋白表达均显著下降。随后进行的体内实验发现，在小鼠双侧肾脏IR之后，肾组织SHP-1表达也同样存在转录和蛋白水平的下调。我们进一步检测了肾组织蛋白的SHP-1磷酸酶活性，结果显示其活性随着再灌注时间延长逐渐降低，并在再灌注24h后达到谷值。这一趋势与SHP-1蛋白表达的改变是一致的。由此表明肾脏IR之后SHP-1的表达和活性确实是受到了抑制的，那么这种调控是由什么原因引起的呢？有研究曾指出ROS可以调控SHP-1的酶活性，而肾脏IR之后存在剧烈的氧化应激反应，伴随着大量的ROS生成。是否IR后的氧化应激参与了对SHP-1表达的调控呢？为了求证这一推论，我们使用H2O2模拟氧化应激刺激TEC和M?，发现H2O2呈剂量和时间依赖性地下调SHP-1的转录和蛋白水平的表达；经质粒转染高表达SHP-1的M?在受到H2O2刺激后同样下调SHP-1的表达。为进一步确证氧化应激对SHP-1表达的调控作用，我们在肾脏缺血前1小时以及再灌注后4小时分别给小鼠腹腔注射MnTMPyP。MnTMPyP是一种确认的超氧化物歧化酶激动剂和抗氧化剂。通过这种效果已得到确认的抑制氧化应激反应的方法，我们发现在生理盐水处理组再灌注后12小时SHP-1mRNA表达明显下调，但这种下调现象在抗氧化处理组就不存在了。从而进一步证实了肾脏IR对于SHP-1的调控是通过氧化应激作用产生的。
　　 本部分的实验结果表明在肾脏IR后SHP-1的表达下调，其机制与氧化应激刺激有关。
　　 二、SHP-1缺陷对肾脏IR损伤的影响及IR后TLRs信号通路的调控机制研究
　　 在本部分实验中，我们采用了SHP-1部分缺陷的杂合子mev/+小鼠来进行体内实验，SHP-1严重缺陷的纯合子mev/mev小鼠的原代细胞来进行体外实验，研究SHP-1缺陷对肾脏IR损伤的影响。磷酸酶活性检测结果证实杂合子mev/+小鼠肾组织中SHP-1磷酸酶活性显著低于WT小鼠。生存分析结果显示SHP-1缺陷的小鼠在肾脏IR后生存期显著缩短，肾功能指标（血肌酐和尿素氮）升高幅度也显著高于同窝对照的野生型小鼠。肾组织病理切片显示SHP-1缺陷小鼠在IR后肾小管细胞大量凋亡，坏死区域明显，管腔堵塞严重，半定量病理评分显著高于野生型小鼠。
　　 随后，我们研究了SHP-1缺陷之后的损伤加剧与炎症反应的关系，免疫组化结果显示在SHP-1缺陷小鼠IR后的肾组织间质中，大量巨噬细胞浸润，程度明显重于野生型小鼠。另外RT-PCR和髓过氧化物酶(MPO)的检测也提示SHP-1缺陷小鼠的肾脏炎症细胞浸润程度显著加重，这就为SHP-1缺陷小鼠偏重的病理损伤提供了解释。
　　 文献报道TLRs信号通路在肾脏IR过程中发挥关键作用，表达在肾实质细胞和造血来源细胞表面的TLR2和TLR4通过识别IR早期直接损伤中受损细胞所释放的内源性配体，活化细胞，产生促炎细胞因子，启动天然免疫反应。促炎细胞因子，包括TNF-α、IL-1β和 IL-6等，都是TLRs信号通路的下游产物，不仅直接介导IR对细胞和组织的损伤，也可以通过自分泌和旁分泌的作用形成级联反应，加重IR造成的损伤。因此，我们进一步研究了SHP-1缺陷对肾脏IR后炎症因子的产生情况的影响。实验结果表明，在再灌注后的各个时间点，SHP-1缺陷小鼠的肾组织炎症因子mRNA和蛋白水平均较野生型小鼠显著升高。使用来自SHP-1纯合子缺陷小鼠的肾小管上皮细胞进行体外IR之后的结果，以及来自SHP-1纯合子缺陷小鼠的骨髓来源树突状细胞、脾脏细胞和腹腔巨噬细胞在经受来自IR后肾组织匀浆刺激之后的结果都再次验证了这一结论。这些显著增加的促炎细胞因子提示TLRs信号通路可能被异常地过度活化。为了证实这一点，我们进一步检测了SHP-1缺陷小鼠肾脏IR前后TLR2、TLR4受体及其内源性配体Biglycan，HMGB1，HAS-1，HAS-2，HAS-3的表达情况，结果显示SHP-1缺陷造成TLRs受体及其内源性配体表达上调。进一步的研究显示，SHP-1缺陷还引起IR后肾组织的MAPK和NF-κB的活化增加，从而证实了TLRs信号通路过度活化是造成下游促炎细胞因子合成剧增的原因。
　　 由于IR损伤与细胞凋亡也密切相关，而又有研究报道声称SHP-1具有促凋亡的
　　 作用。那么SHP-1缺陷对肾脏IR之后的细胞凋亡究竟是什么作用呢？我们的研究显示SHP-1缺陷小鼠的肾组织凋亡水平与野生型小鼠并无明显差异，提示可能另外存在某些促凋亡的机制抵消了SHP-1缺陷所产生的抗凋亡作用。鉴于TNF-α具有极强的促凋亡作用，而SHP-1缺陷之后TNF-α分泌大大增加，因此我们推测这可能是解释SHP-1缺陷后凋亡现象并无改善的机制之一。
　　 本部分研究证实了SHP-1缺陷后肾脏IR损伤显著加剧。这种加剧的损伤主要是炎症反应造成，而TLRs信号的过度活化是造成炎症反应失控的主要原因。
　　 三、过表达SHP-1对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用
　　 在本部分研究中，我们首先构建了可转染小鼠活体的携带SHP-1质粒的腺病毒，通过转染，可以在小鼠肾组织和肝组织中短期内稳定高表达SHP-1。同时，经磷酸酶活性检测发现腺病毒转染后小鼠肾组织的SHP-1酶活性显著升高。我们使用该腺病毒转染野生型小鼠和SHP-1缺陷小鼠，并在转染后48小时施行双肾IR，结果发现过表达SHP-1可以减轻野生型小鼠IR后的肾损伤，而且在SHP-1部分缺陷的小鼠转染过表达SHP-1可以逆转由SHP-1缺陷所导致的IR后损伤加剧。进一步研究显示过表达SHP-1可以显著抑制IR后肾组织内促炎细胞因子的表达，由此从另一个方面证实了SHP-1对IR后炎症反应的负相调控作用。
　　 结合上述三部分的研究，我们得出结论，SHP-1对肾脏IR后的炎症反应过程呈负相调控作用，这种调控主要是通过抑制TLRs信号通路的活化，尤其是抑制TLRs通路中MAPK和NF-κB的活化，从而减少下游TNF-α、IL-1β和 IL-6等生成。根据我们所发现的氧化应激对SHP-1表达和酶活性的抑制作用，我们推测，在正常肾脏的缺血再灌注损伤发病机制中，SHP-1的下调就作为一种被破坏的抗炎机制存在。确证SHP-1的这种负相调控作用将有利于开发针对性的药物，为肾脏以及其他器官的IR损伤提供新的治疗方法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分 肾脏缺血再灌注对SHP-1表达的影响及其机制

第二部分 SHP-1缺陷对肾脏缺血再灌注损伤的影响及其机制

第三部分 过表达SHP-1对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用

小 结

参考文献

文献综述 酪氨酸磷酸酶在肾脏缺血再灌注后TLRs信号通路中的作用

研究生期间承担基金情况/参与编著情况及参加学术活动情况

研究生期间发表论文情况

致 谢