UPT十通道免疫层析试纸盘检测技术平台的建立及其在鼠疫菌抗体谱筛查中的应用

摘要

一．以新型光学材料上转换发光颗粒(Up-Converting Phospher,UCP)为标记物，制备双抗原夹心模式的上转换发光免疫层析(Up-converting PhosphlorTechnology based Later-Flow assay,UPT-LF assay）单靶标抗体检测试纸，在此基础上建立一种UPT-LF十通道试纸盘检测系统。
　　 二．将UPT十通道试纸盘检测系统应用于鼠疫菌感染动物及鼠疫患者血清标本中的十种抗原相应抗体谱的筛查分析，寻找除F1抗原外与鼠疫菌诊断相关的补充型特异性抗原。
　　 方法：
　　 首先在大肠杆菌表达系统中克隆、表达十种鼠疫茵蛋白，经镲柱亲和层析纯化，包涵体形式的表达蛋白经尿素梯度透析复性，获得有活性的重组蛋白，以各重组蛋白为抗原分别常规免疫新西兰大白兔，从免疫兔血清中提取抗体，经正辛酸—硫酸铵法纯化获得各蛋白相应的多克隆抗体IgG。
　　 再以配对的抗原抗体为生物材料研制UPT-LF单靶标抗体检测试纸，用UCP标记抗原，以双抗原夹心模式检测其对应抗体，逐一制备分别检测10种不同抗体靶标的UPT-LF试纸，以含有各种纯化鼠疫菌抗体IgG的兔血清为模拟样品，通过对模拟样品的检测评价各试纸的检测性能，包括定量检测能力、灵敏度、精密性和稳定性四个方面。
　　 将十种试纸通过条件优化以及兼容性调整后整合入UPT-LF十通道试纸盘，使待测样品在分条的情况下进行同步均匀的多重层析，利用UPT十通道生物传感器获取试纸盘对样品的检测数据，最终实现一个样品中十种重要蛋白相关抗体谱的同步检测。通过对相同模拟样品的分条检测和整盘检测的比较，评价UPT十通道试纸盘检测结果与试纸检测结果的一致性。
　　 最后利用此多重检测系统对118份鼠疫菌感染（间接血凝抑制实验检测F1抗体阳性为选择标准）的实际血清（13份猴血清，54份兔血清，51份患者血清）样品中的10种鼠疫菌抗体进行了检测，同时对所有血清样品做了ELISA方法检测，并对UPT和ELISA两种方法的定性检测结果进行了比较分析，还对猴血清中两种检测方法定性结果出现差异的标本做了Western Blot验证。
　　 结果：
　　 一．在大肠杆菌表达系统中成功表达了8种鼠疫菌蛋白，其中YopD和YPO1613为上清形式表达，其余的YPO1089，YPO1303，YPO1435，YPO2131，YPO2118，YPO3827为包涵体形式表达。
　　 二．利用表达的8种蛋白及实验室已有的F1和LcrV蛋白免疫动物，获得了10种蛋白对应的多克隆抗体IgG。其ELISA效价和浓度(mg/ml)分别为：YPO3827抗体(1:51，200，9)，YP02131抗体(1:204，800，20)，LcrV抗体(1:204，800，40)，YPO1089抗体(1:109.600，12)，YP01303抗体(1:25，600，22)，YopD抗体(1:51，200，25)，YPO1435抗体(1:204，800，29)，YPO1613抗体(1:204,800，17)，FI抗体(1:204，800，12)，YPO2118抗体（1:51.200，17）。
　　 三．利用10种配对的鼠疫菌抗原抗体制备了10种双抗原夹心模式检测抗体的UPT-LF试纸。对模拟样品的检测结果显示，10种试纸均有良好的线性定量检测能力，线性拟合决定系数R2在0.93-0.99之间。有5种条的检测灵敏度(F1，YP01435，LcrV，YP01089，YP02131)与ELISA灵敏度持平，其余5种梢低于ELISA。各试纸精密性检测中变异系数(CV)分别在6.4％-15.2%之间，37℃的稳定存放期在10天-21天之间。
　　 四．成功制备了能同时快速检测十种生物靶标的UPT-LF十通道检测系统，包括UPT-LF十通道试纸盘和UPT十通道生物传感器，对模拟样品中10种抗体靶标的检测结果显示，整盘检测和分条检测的结果有良好的一致性，包括样品检测值和重复检测变异系数都基本一致。故试纸盘检测的线性定量能力、灵敏度及精密性和稳定性都可沿用单抗体靶标试纸的检测性能评价结果。
　　 五．对118份实际血清（13份猴血清、54份兔血清、51份患者血清）样品同时用UPT-LF十通道系统与ELISA两种方法进行10种靶标抗体的抗体谱检测分析，检测结果随样品种属不同呈现一定的差异：
　　 ◆猴血清：13份猴血清标本的130个检测中有112个检测定性结果相同，18个定性结果不同，总体无统计学差异。WB验证实验显示18个有差异的检测结果中11份为UPT结果正确，7个为ELISA结果正确。10种靶标抗体中阳性率超过500%的有6种，按由高到低排列依次为，F1(100%)、YopD(100%)、LcrV(92%)、YP9O1303(64%0)、YPO2118(55%)、YPO3827(50%)：
　　 ◆兔血清：54份兔血清标本的540个检测中有349个定性结果相同，191个不同，以两种方法定性结果一致的标本数计算抗体阳性率，超过50%的有3个，依次为F1(100%)、YP01089(75%)、YopD(71.9%)
　　 ◆患者血清：51份患者血清标本的510个检测中有391个定性结果相同，119个不同，以两种方法定性结果一致的标本数计算抗体阳性率，超过50%的有4个，依次为F1(100%)、YopD(83%)、YP01435(61%)、LcrV(54%)。
　　 结论：
　　 一．本研究首次建立了一种UPT免疫层析十通道检测系统，它不仅可检测抗体，也可被用于检测抗原。随着UPT-LF试纸开发种类的增多，此系统还可能被广泛应用于某些疾病相关标志物或食品检验，水源检测等等需要快速多靶标监测的领域。
　　 二．利用此系统同步检测了鼠疫菌感染动物及人血清样品中的10种抗体靶标，尽管抗体谱随样品种属不同呈现一定程度的变化，但F1抗体在不同种属样品中阳性率全部是100%，再次证实F1确实是鼠疫诊断的最可靠靶标，此外YopD抗体也都有很高的阳性率，说明其有作为鼠疫菌感染的辅助诊断靶标的可能。