循环核酸及DNA甲基化在肝细胞癌中的研究

摘要

目的：肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，21世纪以来已成为排在我国第二位的癌症杀手。能够引起肝细胞癌的病因有很多，其中最重要的一个病因就是乙肝病毒 (hepatitis B virus, HBV)或丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)的慢性感染。慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis B, CHB)是一种最常见的高发病率和高死亡率的传染性肝病。我国是一个肝病大国，据统计资料显示，我国的HBsAg 阳性者一共占到总人口的7.18％，总数达到约1.2亿人，其中慢性乙型肝炎患者约有2000万-3000万人。慢性乙型肝炎患者如果得不到及时的诊断和治疗，随着病情的发展就有可能进一步发展成为肝硬化，甚至进一步发展成为肝癌，导致患者死亡。因此对于慢性乙型肝炎患者病情的控制和对肝细胞癌的早期筛查和诊断就显的尤为重要。
　　 尽管近年来肝癌的临床治疗取得了很大的进展，部分肝癌患者得到了较早的诊断并获得了及时的治疗，但肝癌病人总体的预后情况仍不是十分理想，其主要原因是在进行完手术切除以后仍有相当比例的病人发生肝内复发或远处转移。因此，临床上迫切需要一些能够起到早期诊断作用的生物学标志物，以利于预测肝癌病人转移复发的可能，从而进一步延长肝癌病人的生存期。
　　 游离循环核酸 (free circulating nucleic acids)是一种存在于动植物和人体体液中的细胞外游离状态的核酸，包括游离循环DNA和游离循环RNA。其中，游离循环 DNA即Cell-free DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于人体的血清和血浆等体液中。研究显示肿瘤病人的外周血循环中DNA的含量明显增加，伴有转移的肿瘤病人更是高于早期病人，且在循环DNA中可检测到与原发肿瘤细胞相一致的分子遗传学特征。因此，对外周血循环DNA的研究逐渐受到人们的重视，越来越多的研究将重点转移到外周血循环DNA与各种肿瘤的关系上来。
　　 随着对包括肝细胞癌在内的各种肿瘤研究的不断进展，对肿瘤表观遗传学等方面的研究也取得了很多的进展。DNA 甲基化(methylation)是目前研究的最明确的肿瘤表观遗传学机制，指在DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferases，DNMTs)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine，SAM)作为供体，将一活化的甲基基团引入DNA 链，共价结合于胞嘧啶的第5 位碳原子上，使之转变为5-甲基胞嘧(5-methylcytosine，m 5 C)的过程。DNA的异常甲基化与肿瘤的发生和发展有着密切的关系，肿瘤也是涉及到DNA 异常甲基化的一种重要的疾病。因此研究DNA 甲基化与肝细胞癌之间的关系，对于肝细胞癌的早期诊断和治疗也有着重要的意义。
　　 我们通过进行本课题的研究，首先旨在筛选和优化出一种从血清中快速提取循环DNA的方法，然后将这种方法应用于HCC患者、HBV 携带者和正常对照者的血清循环DNA的提取中。通过对这三组人群中的血清循环DNA 进行定量检测来分析血清循环DNA在这三组人群中的含量有无差异，并探讨根治性手术治疗前后HCC患者血清循环DNA水平的变化影响，从而为血清循环DNA能否作为肝细胞癌的辅助诊断标志物提供参考依据。我们还设计相应的实验对肿瘤表观遗传学机制中的DNA 甲基化与肝细胞癌组织之间的关系进行研究，从中探寻DNA 甲基化对肝细胞癌的诊断以及和肝细胞癌临床病理特征的关系。
　　 方法：1.总结四大类共10种从血清中提取循环DNA的方法，用这10种方法来提取混合血清中的循环DNA，使用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)的方法对提取出的循环DNA 进行定量分析，通过计算每一种提取方法提取出来循环DNA的含量来比较这十种提取方法的提取效率，从中筛选出一种提取效率最高的提取方法。
　　 2.选取HCC患者、HBV 携带者和正常对照者的血清各50例，采用上述筛选并优化的抽提方法，应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)对各组血清中的循环DNA 进行定量分析，找出这三组人群中血清循环DNA 含量的差异，并探讨HCC患者血清中循环DNA水平与肝癌临床病理特征的关系。此外还留取HCC患者中的14例根治性手术治疗后平均50天左右的血清，通过对比手术前后HCC患者血清Cell-free DNA水平的变化来比较根治性手术治疗前后HCC患者血清循环DNA水平的变化。
　　 3.选取HCC患者中的35对肝癌和癌旁组织，通过分析这两组组织之间DNA 甲基化的水平来探讨DNA 甲基化在肝细胞癌中的诊断价值和肝癌临床病理特征的关系。
　　 结果：1.在我们选取的四大类共10种提取方法中，我们所总结出的酚-氯仿提取方法中的第三种，即酚-氯仿过夜裂解法为效率最高的一种血清循环DNA的提取方法。
　　 2.HCC患者的血清循环DNA水平高于HBV 携带者和正常对照者，且其差异具有统计学意义(P<0.01)。根治性手术治疗后的HCC患者与治疗前相比，其血清循环DNA水平有下降，其差异也有统计学意义(P<0.01)。DNA 完整性与HCC患者的血清AFP水平和有无肝硬化之间存在着相关性，并具有统计学意义（P<0.05）。
　　 3.肝癌组织的DNA 甲基化水平高于配对的癌旁组织，其差异具有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织的DNA 甲基化总体水平与HCC患者的血清GGT水平之间存在着相关性，且具有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：血清循环DNA 可以为HCC患者早期筛查和诊断提供依据，并有助于疗效及是否合并肝硬化判断；肝癌组织存在特定基因的高甲基化，并与血清GGT水平密切相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：文中常用缩略词表

声明

前 言

第一部分 外周血循环DNA 提取方法的筛选和优化

第二部分 循环DNA 在原发性肝细胞癌中的含量变化及其意义

第三部分 肝癌组织中多种基因启动子区甲基化检测及临床意义

研究工作小结

参考文献

微小RNA 、循环微小RNA 与肿瘤研究进展（综述）

在读期间发表论文和参加科研情况

致 谢