靶向重组腺病毒介导Hsp70基因表达治疗胰腺癌的实验研究

摘要

靶向重组腺病毒介导Hsp70基因表达治疗胰腺癌的实验研究胰腺癌是恶性程度极高的常见消化系肿瘤，尽管近年来在影像学诊断、化疗、围手术期治疗和系统治疗方面取得了一定进展，但胰腺癌尚缺乏有效的治疗手段。因此，寻求有效的针对胰腺癌的治疗手段是目前胰腺癌研究的重要课题。近年来，随着肿瘤免疫学和分子生物学的研究进展，免疫基因治疗已成为胰腺癌综合治疗的有效手段之一。
　　 许多研究结果均证实，Hsp70与免疫调节密切相关，肿瘤细胞来源的Hsp70可诱发针对该肿瘤的特异性免疫反应。Hsp70可与肿瘤细胞内的多肽抗原相结合，Hsp70-多肽复合物作为完整的抗原，与抗原递呈细胞表面的特异性受体结合进入抗原递呈细胞内，经加工后与MHC分子形成复合物而被转运至抗原递呈细胞表面，被T细胞识别，激发抗肿瘤的特异性免疫。Hsp70可以通过上调B7-1, B7-2等共刺激分子以及MHC II分子的表达而促进DC的成熟并能诱导DC和T细胞趋化至肿瘤细胞。此外，肿瘤细胞表面表达的Hsp70还可以激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。动物实验和体外均研究证实，肿瘤细胞来源的Hsp70可作为一种有效地抗肿瘤疫苗。
　　 腺病毒载体由于宿主范围宽广、感染效率高、插入外源基因片段大，可介导外源基因短时呈高水平表达，且易于制备、病毒滴度高，已在成为基础研究和临床基因治疗中使用最多的载体之一。近年来，为了提高腺病毒介导基因治疗的效率，人们利用肿瘤细胞与正常细胞之间的某些生物学性状的差异，构建了肿瘤靶向性重组腺病毒。目前已有为数不少的肿瘤细胞特异启动子被鉴定并用于基因表达的靶向调控，如靶向乳腺癌的MUC1启动子、靶向肝癌的AFP 启动子、靶向前列腺癌的PSA 启动子以及靶向鼻咽癌的EB 病毒启动子等。用上述启动子调控外源基因的表达可获得相对特异的肿瘤靶向作用，在提高肿瘤基因治疗疗效的同时，可控制基因治疗基因表达的安全性、降低其对正常细胞的毒副作用，实行抗肿瘤基因的定向表达。研究显示，CEA在正常胰腺组织中不表达，而在胰腺癌组织中则有高频率的阳性表达率，提示CEA基因表达与胰腺癌密切有关，是胰腺癌基因治疗比较广谱的分子靶标。
　　 基于以上研究，本课题通过克隆Hsp70基因以及CEA 启动子，采用CEA基因启动子控制Hsp70基因的表达，构建靶向重组的腺病毒。通过体内实验检测该重组腺病毒对胰腺癌细胞增值和凋亡的影响，体外实验观察该重组腺病毒对胰腺癌动物模型肿瘤生长的抑制作用，并分析其相关机制。
　　 一、Hsp70基因和CEA 启动子的克隆及CEA 启动子活性检测目的克隆Hsp70基因和CEA 启动子，并对CEA 启动子的活性进行检测。
　　 方法热处理胰腺癌细胞株Panc-1，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，通过PCR的方法扩增Hsp70基因。提取健康志愿者外周血基因组，经PCR的方法扩增CEA启动子。分别将Hsp70基因和CEA 启动子亚克隆至T 载体后，进行DNA 测序。用酶切的方法将CEA 启动子插入到质粒pGL-6的多克隆位点，构建质粒pGL6-pCEA。用电化学发光法检测胰腺癌细胞株培养液中CEA的含量。分别将pGL6-pCEA和pGL6 质粒通过脂质体转入CEA 阳性和阴性胰腺癌细胞中，通过双荧光素酶报告基因系统检测CEA 启动子的活性。
　　 结论成功克隆出Hsp70基因和CEA 启动子，所克隆的CEA 启动子能够在CEA 阳性的肿瘤细胞中较好的驱动下游基因的表达。
　　 二、靶向重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70的构建及鉴定目的构建CEA 启动子驱动下靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒。
　　 方法通过酶切的方法将Hsp70基因插入到质粒PDC316的多克隆位点，并以CEA启动子替换质粒PDC316-Hsp70的启动子MCMV，构建穿梭质粒PDC316-pCEA-Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHG lox △E1, 3Cre在HEK293细胞中进行同源重组获得重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70，以PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。
　　 通过CsCl 梯度离心法纯化病毒，TCID50法测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA 阴性的胰腺癌细胞株SW1990和CEA 阳性的BxPC-3、DSL-6A/C1，通过PCR和ELISA 检测Hsp70基因mRNA和蛋白表达情况。
　　 结论成功构建了能够在CEA 阳性的细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70，为进一步研究奠定了基础。
　　 三、重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70治疗胰腺癌的实验研究目的观察重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70对体外培养的胰腺癌细胞增值和凋亡的影响以及对大鼠胰腺癌动物模型肿瘤生长的影响，并分析其相关机制。
　　 方法以重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70感染胰腺癌细胞株，通过MTT 法检测细胞增值活力的变化，流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响。建立大鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，随机分为三组，分别给予Ad5-pCEA-Hsp70、Ad5-control 以及PBS 进行治疗。对比不同时间点三组肿瘤大小，评价抑瘤效果。取血检验生化指标，并用ELISA的方法检测外周血Hsp70蛋白含量及细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的含量。取动物的移植瘤常规HE染色，观察淋巴细胞浸润情况；免疫组化染色检测CD4+T和CD8+T 染色积分；TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况。分离动物脾脏单核细胞，通过流式细胞仪检测CD83+细胞比例，并观察脾淋巴细胞对体外培养的大鼠胰腺癌细胞的杀伤能力。
　　 结论重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有明确的抑制作用，其机制与促进DC的成熟、诱导细胞因子INF-γ、TNF-α、IL-6的分泌、促进CD4+T和CD8+T淋巴细胞浸润有关。
　　 小结：本课题通过克隆Hsp70基因和CEA 启动子，构建CEA 启动子驱动下表达Hsp70基因的靶向重组腺病毒。动物实验表明，重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70介导的Hsp70基因表达对大鼠胰腺癌动物模型的肿瘤生长具有明确的抑制作用，其机制与诱导机体的抗肿瘤免疫反应有关，且对机体无明显毒副反应。我们的研究为进一步利用该重组腺病毒靶向性的治疗胰腺癌患者提供了理论依据和实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略语表

声明

前言

第一部分Hsp70基因和CEA启动子的克隆及CEA启动子活性检测

第二部分靶向重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70的构建及鉴定

第三部分重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70治疗胰腺癌的实验研究

全文总结

文献综述热休克蛋白70与肿瘤免疫

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