基于改造茉莉酸甲酯生物合成途径的丹参次生代谢工程新策略

摘要

植物次生代谢产物是植物为了抵御外界刺激如微生物入侵与昆虫、食草动物伤害等胁迫而产生的化合物，如抗生素、生物碱、毒素等。许多次生代谢产物具有很好的药理活性，是中药和天然植物药的主要有效成分。在外界生物或非生物的压力胁迫下，一些植物激素，如脱落酸、水杨酸、乙烯以及茉莉酸甲酯(MeJA)等在植物中大量积累，通过相互作用，调控植物的信号传递、胁迫耐受以及次生代谢等过程，形成植物的应激系统。其中，茉莉酸甲酯在植物应激反应和次生代谢调控中起着至关重要的作用。目前，MeJA作为外源诱导子促进植物次生代谢物的过量积累，已得到广泛应用。本研究探索一种新的代谢工程策略，通过过量表达植物MeJA合成途径上的关键酶基因，提高内源MeJA的含量，进而刺激多种次生代谢产物的合成与积累。为了使这种新策略应用于多种植物，节省大量克隆内源基因的工作。本研究同时将内源和异源基因在植物中过量表达，考察是否达到同样的效果。
　　 在植物的茉莉酸甲酯生物合成途径中，丙二烯氧化物环化酶allene oxide cycalse(AOC)和茉莉酸羧甲基转运酶jamonic acid carboxyl methyltransferase(JMT)是重要的关键酶。本研究采用RACE方法，从丹参中克隆了AOC基因(SmAOC，GenBank登录号：HM156740)，其cDNA全长为910bp，开放阅读框(ORF区)编码的蛋白质共有245个氨基酸。该基因与其他物种中的AOC基因具有较高的同源性，与水稻OsAOC的相似度为75％，与玉米ZmAOC的相似度为74％。器官组成型分析，SmAOC在丹参中根茎叶均有分布，叶中表达量最高。Southern杂交结果显示SmAOC在丹参中是一个低拷贝基因；RT—QPCR分析显示AOC基因表达可被多种不同的诱导因素，如：茉莉酸甲酯、紫外线照射、低温胁迫所诱导，而提高表达水平。原核表达SmAOC，SDS—PAGE电泳检测得到了预期表达的目的蛋白。耐盐胁迫试验表明，表达SmAOC蛋白的细菌比对照更耐受高盐环境。
　　 丹参中两大类活性成分主要是以丹参酮ⅡA为代表的脂溶性二萜醌类化合物和以丹参酚酸B为代表的水溶性化合物。在根癌农杆菌C58C1介导的丹参发根中分别过量表达MeJA合成途径中的关键酶：内源的丹参SmAOC，异源的莨菪HnAOC和拟南芥AtJMT，结果显示在各转基因事件中，上述两类化合物的含量基本上均比对照有不同程度提高。在所有转基因株系中。转SmAOC组的S—7株系丹参酮ⅡA提高最多，达到野生发根的16．6倍，干重含量从0．037mg/g提高到0．56mg/g；转AtJMT组的J—5株系隐丹参酮提高最多，达到野生发根的16．8倍，干重含量从0．027mg/g提高到0．46mg/g；转HnAOC组的H—11株系迷迭香酸提高最多，达到野生型对照的2．19倍，干重含量从1．32mg/g提高到2．89mg/g；转SmAOC组的S—1株系丹参酚酸B最多比野生型对照发根提高了78％，干重含量从10．73mg/g提高到19．07mg/g。转基因丹参发根中其他活性物质(丹参酮Ⅰ和二氢丹参酮)以及迷迭香酸合成途径的中间体的含量也有不同程度的提高。同时RT—QPCR技术检测了MeJA、迷迭香酸及萜类合成途径上基因的表达水平，结果显示，转基因发根中的这些合成途径上的相关基因均有相应地上调。
　　 本研究从多种转基因事件证明了，MeJA生物合成途径的基因操作可以同时对多个酶促反应或者多条代谢途径进行全局调控，从而提高植物体内多种次生代谢产物的含量，并且过量表达异源和内源基因能够产生同样的效果。通过遗传转化获得的次生代谢产物含量的提高是稳定且持久的，体现出比外源诱导更可靠更稳定可遗传的优越性，为生产受MeJA诱导的次生代谢产物提供了一个有效的基因工程新策略。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

第一章 前言

第二章 丹参MeJA合成途径SmAOC的全长克隆

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第三章 SmAOC组织特异性和诱导表达分析

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第四章 原核表达及抗盐性实验

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第五章 农杆菌介导的三组转基因发根的培养

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第六章 转基因发根目标化合物合成途径上相关基因的表达分析

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

第七章 转基因发根活性成分及合成中间体含量分析

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、小结与讨论

研究总结

附录

参考文献

硕士在读期间论文投稿及发表情况

致谢