P2Y2受体对大鼠三叉神经节神经元介导瞬时外向钾电流的电压门控性钾通道的抑制作用研究

摘要

[研究目的]
　　 慢性疼痛的发病率在全球范围内接近20％～25％。目前的治疗方法无法使大部分慢性疼痛患者解除痛苦。因此，有必要探寻治疗慢性疼痛的新方法，这会使很多患者改善生活质量。三叉神经痛(trigeminalneuralgia，TN)是一种三叉神经分布区域中的反复的刀刺般剧痛的疾病。这种发作存在扳机点，特别在说话、咀嚼、刷牙、剃须以及轻触时，甚至凉风也能引起。这种发作常常是单侧的，一天之内可能重复出现，非常痛苦。然而由于其发病机制尚不完全清楚，到目前为止，临床上仍缺乏满意地镇痛药物。TN发作时三叉神经轴上各级神经元(三叉神经节神经元和三叉神经感觉主核、脊束核、下丘脑、大脑皮层的神经元)兴奋性提高，易化性增强，痛觉阈值降低。这种兴奋性的提高导致在受到轻微刺激或无刺激时，神经元阵发性大幅度放电，传入中枢引起剧痛。但是这些神经元兴奋性的极度提高和大幅度放电的形成原因是什么，尚需进一步研究。P2受体是病理性疼痛传递中的关键蛋白，可以被外周伤害性刺激激活，引起背根神经节(dorsalrootganglion，DRG)神经元或者TG神经元细胞膜去极化。Kv通道由于参与动作电位的调节而成为疼痛治疗的潜在的靶标。最近有报道称选择性的Kv7通道的开放剂(retigabine)可以选择性地降低伤害性感受传入纤维的兴奋性。在三叉神经病理性疼痛或者炎性痛模型中，KV通道介导的IA和Ik与正常大鼠相比显著降低。由于IA和Ik在神经元动作电位的发生频率和间期的调节中起到了重要的作用。因而本实验拟利用痛觉行为学，电生理学和分子生物学等方法探讨P2受体对KV通道的调节及机制，研究参与调节IA通道的P2受体亚型及其中的途径，从而寻找三叉神经病理性痛相关的靶点，为临床治疗提供理论依据。
　　 [研究方法]
　　 1、动物分组：①正常SD雄性大鼠200～250g，随机分组进行免疫组化双标实验：荧光金(FG)和P2Y2；P2Y2与Kv1.4：P2Y2与Kv3.4；P2Y2与Kv4.2；P2Y2与Kv4.3。正常SD雄性大鼠80～120g，培养TG神经元随机分组，分别给予UTP/ATP，Surmain和U0126等药物处理。②ION-CCI大鼠：SD雄性大鼠200～250g，随机分为假手术组和手术组。
　　 2、实验方法：①大鼠ION-CCI术；②经眶下孔达TG目标注射给药法；③大鼠痛觉行为学测定；④三叉神经节细胞分离培养；⑤免疫荧光组织化学方法和细胞免疫荧光化学方法；⑥P2Y2反义寡核苷酸干扰方法；⑦实时定量RT-PCR；⑧Westernblotting；⑨细胞电生理记录。
　　 [结果]
　　 一、正常大鼠
　　 1、ATP对TG神经元快速作用：电生理结果显示，在培养的大鼠TG神经元上给予ATP后，①产生T型ATP电流的TG神经元IA被抑制，IA峰电流从(4.18±0.63)nA(n=14)减小到(1.34±0.22)nA(n=13)，(P<0.05，pairedt-test)；②产生S型ATP电流的TG神经元IA无显著影响；③部分ATP不敏感型TG神经元IA也受到抑制。
　　 2、免疫荧光组化方法显示：P2Y2受体与介导IA的Kv通道亚型Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2以及Kv4.3分别高比率地共同表达在TG神经元上。
　　 3、ATP对TG神经元长时程作用：①电生理结果显示，激活的P2Y2受体降低大鼠TG神经元产生动作电位的阈电流：147.1±32.9pA变为58.3±10.3pA(control：n=7；UTP：n=9，**P<0.01)，增加动作电位数目(control：1.3±0.9spikes/400ms，n=3；UTP：10.8±3.5spikes/400ms，n=4，*P<0.05)；②电生理结果显示，激活的P2Y2受体对IA的抑制作用可被选择性P2Y2受体阻断剂Suramin阻断(control：0.14±0.01nAvsUTP：0.09±0.01pA.n=20,P<0.05；Suramin：0.13±0.01pA，n=9，P>0.05vscontrol)；③电生理结果显示，激活的P2Y2受体对IA的抑制作用可被ERK拮抗剂U0126阻断(Control：0.14±0.01nAvsUTP：0.09±0.01pA，n=20,P<0.05；U0126：0.15±0.03pA，n=11，P>0.05vscontrol)：④实时定量RT-PCR结果显示，激活的P2Y2受体显著抑制Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2以及Kv4.3的mRNA表达。
　　 二、ION-CCI大鼠
　　 1、免疫荧光组化方法显示：ION-CCI术后，大鼠P2Y2受体阳性的神经元表达Kv1.4，Kv3.4.Kv4.2以及Kv4.3显著减少。
　　 2、ION-CCI大鼠，经眶下孔达TG目标注射给药法给予Suramin，其触须垫部位机械痛阈呈剂量依赖性恢复(saline：0.96±0.4gn=8，Suramin0.3:11.45±2.4gn=7，Suramin3：29.96±4.1gn=6，**P<0.01；##P<0.01vsSuramin0.3)，维持45min。
　　 3、ION-CCI大鼠，经眶下孔达TG目标注射给药法给予P2Y2反义寡核苷酸(P2Y2受体下调)，其触须垫部位机械痛阈显著恢复(saline：0.49±0.1gn=7；antisense：49.54±8.0gn=5.P<0.001)，维持120h。
　　 4、ION-CCI大鼠，经眶下孔达TG目标注射给药法给予P2Y2反义寡核苷酸(P2Y2受体下调)，ION-CCI大鼠TG神经元Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2mRNA表达显著增加。
　　 5、ION-CCI大鼠，经眶下孔达TG目标注射给药法给予P2Y2反义寡核苷酸(P2Y2受体下调)，大鼠TG神经元中pERK的蛋白表达显著降低。
　　 [结论]
　　 在大鼠三又神经节神经元，P2Y2受体可能通过ERK途径，下调TG神经元Kv1.4、Kv3.4和Kv4.2表达，进而提高TG神经元兴奋性。P2Y2受体下调可显著逆转ION-CCI大鼠面部痛觉过敏。这些结果提示控制P2Y2受体的表达将成为临床神经病理性痛治疗的关键措施之一，将为寻找新型的神经病理性痛治疗药物提供理论依据。