1、肝癌差异表达miRNAs阵列分析及miR-138、miR-483-5p与肝癌发生机理的研究2、HBx诱发anti-URGs用于肝硬化肝癌高危人群预警的实验研究

摘要

第一部分：
　　 肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球肿瘤病人死亡的主要原因之一。肝癌5年生存率不足5％，肝癌病人确诊越晚，其预后效果越差。晚期诊断严重限制了肝癌治疗手段的选择，因此肝癌的早期发现非常重要，阐明肝癌发生机制将有助于寻找早期诊断肝癌的肿瘤标记物。
　　 MicroRNA(miRNA)是一类可调控基因表达的非编码RNA家族，能通过与mRNA分子相互作用导致RNA降解或阻遏蛋白质翻译。成熟的miRNA是一种约20-22nt长的单链RNA分子，可通过完全或不完全碱基配对与mRNA分子3’UTR相结合，从而抑制靶基因的翻译，参与细胞一系列的重要过程，包括细胞分化、细胞增殖与细胞凋亡。越来越多的研究表明肿瘤细胞与癌旁组织来源细胞间miRNA表达谱具有明显差异，miRNA表达谱可将肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病与临近正常组织分开。半数以上的miRNA定位于与肿瘤发生相关的染色体区域和脆性位点，提示miRNA在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。因此研究与肝癌发生、发展相关的miRNA表达谱的变化，探索肝癌发生发展的分子机制，这对肝癌的早期诊断和及时防治具有非常重要的意义。
　　 在本研究中通过检测临床肝癌标本与癌旁组织标本中miRNA的表达谱，对筛选出的差异表达miRNA，以定量RT-PCR和Westernblotting分析其相对应靶蛋白的表达状况，探讨其在HCC发生发展中的作用机制。
　　 一、肝癌差异表达miRNAs阵列分析
　　 miRNA与肿瘤的发生密切相关，目前已经发现miRNA在许多肿瘤中差异表达，但miRNA在肝癌发生发展中的研究尚不多。本部分通过Taqman低密度miRNA阵列(ThqmanlowdensitymiRNAarray，TLDA)分析了3对肝癌癌组织与其癌旁组织中667种miRNA表达谱差异。应用HierarchicalCluster软件将24种差异表达的miRNA进行聚类分析，利用RealtimeRT-PCR在另外18对肝癌癌组织中验证出了20种miRNA的差异表达，进一步对差异表达miRNA的靶蛋白进行预测，并分析其参与的细胞功能和信号通路，绘制miRNA-靶蛋白mRNA网络图。
　　 结果如下：
　　 在本实验中，Taqman低密度miRNA阵列检测结果显示24种miRNA在肝癌组织与非肝癌组织间呈现差异表达，每种miRNA表达数值均与U6表达值相比进行标化。其中11种miRNA在癌组织中相对于在癌旁组织中上调表达，13种miRNA在癌组织中下调表达。应用HierarchicalCluster软件将24种差异表达miRNA进行聚类时，可基本将肝癌组织与毗邻癌旁组织分开。利用RealtimeRT-PCR检测上述24种miRNA在另外18例肝癌病人癌组织与非癌组织中的表达情况，证实了10种上调表达的miRNA(miR-217，miR-518b，miR-517c，miR-520g，miR-519a，miR-522，miR-518e，miR-525-3p，miR-512-3p，andmiR-518a-3p)和10种下调表达的miRNA(miR-138，miR-214，miR-214#，miR-27a#，miR-199a-5p，miR-433，miR-511，miR-592，miR-483-5pandmiR-483-3p)。
　　 预测上述差异表达miRNA的靶基因，并进行靶基因的功能分类(GO)和信号通路分析(KEGGPathway)可知，signaltransduction是这些miRNA调控的最重要的细胞功能，而regulationofactinskeleton和panthwayincancer是这些miRNA调控的最重要的信号通路。绘制miRNA与靶基因调控网络图，可以得知：miR-519a和miR-199-5p可能是起到主导作用的miRNA，而RPS6KA3、SMAD4、ACVR2A等基因可能是与肝癌发生发展相关的重要基因。基于上述研究结果，选取miR-519a、miR-199a-5p、miR-138、miR-483-5p和miR-520g进一步深入研究。
　　 二、miR-138调控细胞周期蛋白D3(CCND3)引起G1期阻滞
　　 miR-138在肝组织中表达量较高，且在肝癌中呈现明显下调表达，推测miR-138与HCC的发生发展密切相关，但是它在HCC中的作用机制尚不清楚。本研究对miR-138调控靶基因及其在肿瘤发生中的功能研究进行更深入的研究。应用miRNA靶标预测软件TargetScan和miRnada预测miR-138靶基因。常规培养人肝癌细胞HepG2和Huh7，进行脂质体瞬时转染后，定量RT-PCR检测CCND3的表达量，Celltiterblue检测肝癌细胞活性，应用流式细胞技术检测细胞周期的改变，WesternBlotting用于检测CCND3蛋白水平的改变。
　　 结果如下：
　　 采用TargetScan和miRanda软件预测到CCND3为miR-138的靶基因。WesternBlotting结果显示，miR-138在肝癌中发生不同程度的下调，而CCND3是上调表达，两者呈负相关。在HepG2和Huh7细胞中转染miR-138模拟物，发现CCND3蛋白表达被下调，而转染miR-138抑制物，CCND3蛋白表达上调。外源表达miR-138抑制CCND3蛋白的表达，同时减弱了细胞的生长速度。与之相反的是，抑制细胞内miR-138表达则促进细胞的生长速度。应用流式细胞仪检miR-138对细胞周期及凋亡的影响，结果发现转染miR-138模拟物，细胞G0/G1期延长，S期相应缩短；与之相反的是转染miR-138抑制物，细胞G0/G1期缩短，S期相应延长。在裸鼠模型中，皮下注射转染miR-138模拟物或抑制物的HepG2细胞，连续观察5周，从第3周开始注射了转染miR-138模拟物HepG2细胞的肿瘤显著小于未转染HepG2对照组，而注射了转染miR-138抑制物HepG2细胞的肿瘤显著大于未转染HepG2对照组，此动物体内的肿瘤抑制实验再次验证了miR-138的抑制肿瘤细胞生长的作用。
　　 三、miR-483-5p调控的维甲酸诱导蛋白16(RA116)是一种新的癌蛋白和肝癌标志物
　　 miR-483-5p在肝癌中呈现明显下调表达，推测miR-483-5p与HCC的发生发展密切相关，但是它在HCC中的作用机制尚不清楚。本研究对miR-483-5p调控靶基因及其在肿瘤发生中的功能研究进行更深入的研究。应用miRNA靶标预测软件TargetScan和miRnada预测miR-483-5p靶基因。常规培养人肝癌细胞HepG2和Huh7，进行脂质体瞬时转染后，定量RT-PCR检测CCND3的表达量，Celltiterblue检测肝癌细胞活性，应用流式细胞技术检测细胞周期的改变，WesternBlotting用于检测RA116蛋白水平的改变。
　　 结果如下：
　　 采用TargetScan和miRanda软件预测到RA116为miR-483-5p的靶蛋白。WesternBlotting结果显示，miR-483-5p在肝癌中发生不同程度的下调，而RA116是上调表达，两者呈负相关。在HepG2和Huh7细胞中转染miR-483-5p模拟物，发现RA116蛋白表达被下调，而转染miR-483-5p抑制物，RA116蛋白表达上调。外源表达miR-483-5p抑制RA116蛋白的表达，同时减弱了细胞的生长速度。与之相反的是，抑制细胞内miR-483-5p表达则促进细胞的生长速度。应用流式细胞仪检miR-483-5p对细胞周期及凋亡的影响，结果发现转染miR-483-5p模拟物，细胞G0/G1期延长，S期相应缩短；与之相反的是转染miR-483-5p抑制物，细胞G0/G1期缩短，S期相应延长。在裸鼠模型中，皮下注射转染pcDNA3.1-RA116或siRNA-RA116的HepG2细胞，连续观察5周，从第3周开始注射了转染pcDNA3.1-RA116HepG2细胞的肿瘤显著大于未转染HepG2对照组，而注射了转染siRNA-RA116HepG2细胞的肿瘤显著小于未转染HepG2对照组，此动物体内的肿瘤抑制实验再次验证了RA116的促进瘤细胞生长的作用。
　　 四、结论:
　　 本研究在配对肝癌样本中筛选出20个差异表达miRNA，包括10个上调的miRNA和10个下调的miRNA。上述差异表达miRNA的靶基因的功能分类(GO)和信号通路(KEGGPathway)分析可知，signaltransduction是这些miRNA调控的最重要的细胞功能，而regulationofactinskeleton和panthwayincancer是这些miRNA调控的最重要的信号通路。而miR-519a、miR-199a-5p、miR-138、miR-483-5p和miR-520g在这些差异表达miRNAs中起主导作用，值得进一步深入研究。
　　 对miR-138深入的研究表明：miR-138调控CCND3的表达，诱导细胞周期在G0/G1期停滞，进而抑制肝癌细胞的生长。在HCC组织中，miR-138下调表达，减弱了对CCND3的调控，CCND3呈上调表达，失去对细胞周期控制，肿瘤细胞生长速度加快。综上说明miR-138在HCC的发生发展中发挥抑癌基因的作用，这将为HCC的诊断与治疗带来新的曙光。
　　 对miR-483-5p及其靶蛋白RA116的深入研究表明：miR-483-5p调控RA116的表达，诱导细胞周期在G0/G1期停滞，进而抑制肝癌细胞的生长。在HCC组织中，miR-483-5p下调表达，减弱了对RA116的调控，RA116呈上调表达，失去对细胞周期控制，肿瘤细胞生长速度加快。综上说明miR-483-5p和RA116在HCC的发生发展中发挥重要作用，这深入对HCC致病机理的认识提供新的思路。
　　 第二部分：HBx诱发anti-URGs用于肝硬化肝癌高危人群预警的实验研究
　　 肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是目前最为常见的癌症之一。在我国，肝癌的发病率高与乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染密不可分，相当一部分的慢性乙肝迁延不愈，并经肝纤维化、肝硬化进程向肝癌转化。但对慢乙肝发生和转归的分子机制认知严重不足，缺少有效的早期诊断和干预、治疗手段，难以阻断大量病患从慢性肝炎向肝硬化和肝癌发展。
　　 目前，甲胎蛋白(AFP)用于诊断HCC已被广泛认可，但实属无奈之选。越来越多的文献报道了AFP在诊断和监测HCC的局限性。事实上，按照目前的HCC诊断标准，当AFP和影像学检查出现异常时，肝癌往往已发展到晚期，多数患者已失去了宝贵的早期干预治疗的机会。此外，有3个最有可能用于HCC辅助诊断的标志物：AFP的异构体(AFP-L3％)、人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)及去γ羟基凝血素(DCP)。其他已报道的标志物还有肝癌癌蛋白p28GANK、高尔基磷蛋白(GOLPH2/GP73)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)和肝细胞生长因子(HGF)等，但上述潜力标志物，即使联合应用，对于HCC诊断的敏感度仍不能达到作为理想标志物的标准。因此，探究肝炎发展为肝癌的致病机制，寻找理想的肝癌标志物，最终实现阻断或减缓肝炎向肝硬化肝癌转化，降低肝癌的发病率和死亡率，仍需不懈的努力。
　　 课题组前期工作发现了5种HBx诱导的高表达蛋白(URG4，URG7，URG11，URG12和Suil)，URG4和URG11是癌基因，能够促进肿瘤生长；URG7具有抵抗Fas介导细胞凋亡的作用；URG12是核糖体蛋白，而Suil是转录启始因子，两者对于蛋白翻译的完整性非常重要。这5种高表达蛋白都具有刺激肝细胞生长和抵抗TNF作用的特性，其抗体与肝炎发展至肝癌的进程密切相关，上述蛋白的抗体(anti-URGs)是否可作为肝癌标志物，监测肝炎发展为肝硬化、肝癌的进程，用于HCC的早期诊断和高危人群的筛查值得进一步研究。
　　 一、合成多肽抗原检测anti-URGsELISA方法的建立
　　 针对5种URGs的蛋白序列，设计并合成14-22氨基酸长度的多肽作为包被抗原，建立检测血清中anti-URGs抗体的间接ELISA方法。在包被液、多肽抗原包被浓度、封闭剂、封闭时间、血清稀释度、血清反应时间和显色时间方面对检测方法进行优化，确定Cut-off值，并评估检测方法的敏感性、特异性、精确性和稳定性。
　　 结果如下：
　　 1、建立了合成多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，检测流程为：多肽抗原以10ug/ml的浓度用pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃包被过夜，含3％BSA的Tris缓冲液37℃封闭2小时以上，按照1:10稀释加入血清4℃过夜，充分洗涤后加入HRP标记山羊抗人IgG，37℃孵育30分钟，充分洗涤后加入TMB，避光显色10分钟，2M硫酸终止反应后测OD值。
　　 2、确定了ELISA检测anti-URG4、anti-URG7、anti-URG11、anti-URG12和anti-Suil的Cut-off值分别为：0.103、0.098、0.101、0.107和0.113。
　　 3、ELISA方法具有较好的敏感性(稀释倍数20-640倍)和特异性(多肽抗原可阻断76.9-89.6％的反应)，检测试剂批内差3.2-4.5％，批间差7.4-10.3％，在4℃可保存至少5个月。
　　 二、anti-URGs在乙型肝炎发展为肝癌进程中预警作用的研究
　　 采用自行建立的多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，大规模检测肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中的5种anti-URGs，进行了下列研究：
　　 1、anti-URGs与肝炎发展为肝癌进程的相关性研究：检测全部血清样本中5种anti-URGs，OD值大于或等于Cutoff值的判定为阳性，反之为阴性。利用统计学分析软件对实验数据进行分析，确定anti-URGs阳性数在健康献血员组、肝炎组、肝硬化组和肝癌组之间是否有统计学差异，即anti-URGs与肝炎发展为肝硬化、肝癌进展是否相关，并进一步评估anti-URGs用于HCC高危人群的筛查与小肝癌的早期诊断的可靠性。
　　 2、anti-URGs检查与AFP及其他标志物的对照研究：在肝炎、肝硬化、肝癌患者组中，对比anti-URGs检查与现有的AFP结合影像学检查的敏感度、特异度、阳性率和符合率。单独使用anti-URGs及其他已报道的标志物，包括AFP-L3％、GPC3和GP73等，对比其敏感度、特异度、阳性率和符合率；以多种方式联合使用anti-URGs及其他已报道的标志物，是否可提高检测的敏感度、特异度、阳性率和符合率。
　　 3、anti-URGs对于原发性肝癌发生、复发等的前瞻性研究：A在乙肝肝炎患者组中，追踪anti-URGs的动态变化，对比3种以上(包括3种)anti-URGs阳性和3种以下anti-URGs阳性的患者病情发展、转归的差异；B在肝硬化、肝癌患者组中，追踪治疗前后anti-URGs的变化，对比anti-URGs持续阳性和anti-URGs转阴的患者癌症复发及生存时间的差异。
　　 4、anti-URGs对于肝癌高危人群筛查的前瞻性研究：在乙肝病毒携带者与慢乙肝患者组中，对比3种或3种以上anti-URGs阳性、2种anti-URGs阳性、1种anti-URGs阳性和anti-URGs阳性全阴性的患者病情发展的差异。
　　 结果如下：
　　 1、发现全部558份患者血清和108份健康献血员血清中anti-URGs阳性个数在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌及健康献血员组中有明显差异(P<0.001)，在健康献血员组，91.7％小于等于1个anti-URGs阳性，在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌组中，大于等于3个anti-URGs阳性的比例分别为：35.8％、60.7％和55.2％，此结果提示anti-URGs与肝炎发展为肝癌进程相关。
　　 2、按照在5种anti-URGs中有3个或3个以上阳性则判定为anti-URGs阳性的标准，在肝硬化和肝癌患者中检测敏感度为58.3％，在健康献血员中的特异度为99.1％，在HBV感染无症状携带者中的特异度为87.7％，在其他癌症患者中的特异度为90.0％。
　　 3、为全面评价anti-URGs作为肝硬化肝癌高危人群预警的肿瘤标志物的可靠性，本研究还同时检测了血清中的AFP、AFP-L3％、GPC3和GP73含量。在HBV相关肝硬化和肝癌组中，anti-URGs的敏感度为60.0％和53.3％；AFP的敏感度为33.3％和30.0％；AFP-L3％的敏感度为40.0％和33.3％；GPC3的敏感度为36.3％和23.3％；GP73的敏感度为53.3％和33.3％；在健康献血员组中，anti-URGs的特异度为100％，AFP、AFP-L3％、GPC3、GP73的特异度分别为93.4％，96.7％，93.4％和93.4％。将anti-URGs分别与AFP、AFP-L3％、GPC3和GP73联合检测，可部分提高敏感度，在肝硬化组为76.6％，73.3％，73.3％和76.6％，在肝癌组为60.3％，60.3％，60.0％和60.0％。
　　 4、对10例肝硬化患者的进一步追踪研究显示anti-URGs阳性的肝硬化患者24个月内发生肝癌的几率大幅升高(anti-URGs阳性组：6/10人，anti-URGs阴性组：1/10人)，提示anti-URGs与肝硬化肝癌发生的风险性相关，anti-URGs阳性的患者应给予适当的预防性治疗及定期随访。
　　 5、对于10例HBV相关肝癌患者治疗前后系列血清中anti-URGs进行检测发现，anti-URGs在肝癌临床诊断前即可出现，在治疗后发生转阴，而在个别癌症复发的患者血清中持续阳性。
　　 三、结论:
　　 本课题建立了多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，并对HBV相关急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清，其他癌症患者、HCV肝炎肝硬化患者以及健康献血员血清进行规模化检测，结果显示：anti-URGs在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌组中的检出率分别为21.7％、60.2％和55.1％，存在明显统计学差异(P<0.001)，anti-URGs的确与HBV相关的肝炎、肝硬化和肝癌的病情发展相关，anti-URGs在肝硬化和肝癌患者中检测敏感度为58.3％，在健康献血员中的特异度为99.1％。因此，anti-URGs可以作为肝硬化、肝癌高危人群预警的血清标志物。
　　 本课题研究的创新点在于：(1)本课题首次将anti-URGs作为监测肝炎发展为肝癌进程的血清标志物，具有较好的敏感度和特异度，具有先进性。(2)anti-URGs与肝癌发展的多个方面相关，采用anti-URGs与AFP、AFP-L3％或GP73等组合检测时可提高检测敏感度15％。(3)本课题着眼于HBV感染后病情由肝炎发展为肝硬化、肝癌的整个进程的监测以及相应的肝硬化、肝癌高危人群预警的血清标志物的筛选和评估。在肝炎和肝硬化阶段血清中即已出现3个或3个以上anti-URGs阳性的患者，具有发展成为肝癌患者的高风险性，应例行血清学和影像学检查，尽早进行干预和有效的治疗。本课题的完成将有助于原发性肝癌的预警、诊断和预后，阻断肝炎病患向肝硬化肝癌转化，降低肝癌的发病率和死亡率。