GIST中KIT受体二聚化及靶向阻断研究

摘要

背景与目的
　　 胃肠道间质瘤(gastrointe stinal stromal tumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤。C-kit/PDGFRA基因发生功能获得性突变使KIT受体蛋白自主二聚化，形成KIT同源二聚体(KIT-KIT homodimer)或KIT异源二聚体(KIT-PDGFRa heterodimer)被认为是GIST最主要的发病机制。但是越来越多的研究显示KIT/SCF自-旁分泌所激活的配体依赖的信号通路广泛存在于GIST中，且这种激活不仅与野生型GIST的发生相关，也与突变型GIST的进展密切相关。
　　 我们推测，阻断KIT-dimer的形成可以同时阻断配体依赖和配体非依赖两条信号通路，从而解决伊马替尼(imatinib)耐药问题，探索一种更有效的新治疗方法。尽管KIT-dimer的结构及形成机制早已在分子晶体学中阐明，但是GIST中如何有效检测出KiT-dimer的表达，KiT-dimer的表达程度与GIST的临床病理指标及预后是否存在一定关系，迄今未见有报道。因此，本课题旨在建立一种简便方法检测GIST中KIT-dimer的表达，探讨其表达与GIST的临床病理指标和预后指标的关系。并且依据戴默赛特(Dimercept，Herstatin)阻断HER-dimer形成的思路，制备了一组特异性结合KIT受体二聚化功能区的鼠源性单克隆抗体(KITMAb)，并在细胞学水平初步筛选具有靶向阻断效果的KITMAb。
　　 方法
　　 1、收集已确诊为GISI的新鲜组织及石蜡组织标本共49例，Native-PAGE及SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(western blot)技术检测GIST组织中KIT-dimer的表达，并分析KIT-dimer表达与发病年龄、性别、肿瘤部位、大小、细胞核分裂数/50HPF、肿瘤危险度分级及Ki-67增殖指数的关系；
　　 2、抽提GIST组织基因组DNA，以此为模板，采用PCR方法扩增c-kit基因最常见的突变位点外显子11、9，将PCR产物进行DNA直接测序，检测GIST中c-kit基因的突变状态，结合KIT-dimer的表达情况，分析KIT-dimer表达与GIST中基因突变状态的关系；同时利用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHc)技术检测GIST组织中SCF的表达，分析KiT-dimer表达与SCF表达的关系；
　　 3、采用经典的抗体制备方法，制备一组能特异性与KIT蛋白二聚化结构域相结合的鼠源性单克隆抗体--KITMAb，利用SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(western blot)及免疫组织化学的方法对候选KITMAb进行检测，筛选出组织学定位准确及分子量符合预期标准的KITMAb；
　　 4、将本实验室保存的pcDNA3.1空白质粒(P)、KIT野生型pcDNA3.1(W)、KIT突变型pcDNA3.1(M)通过脂质体法分别稳定转染293细胞，并同时将带有绿色荧光的pcDNA6.2质粒转染293细胞观察转染效率，用Native-PAGE、SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)技术检测靶细胞KIT蛋白的表达情况；将不同浓度的6株候选KITMAb分别与三株稳转细胞共同孵育，2-(4，5-二甲基噻唑-2)-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞增殖活性，Native-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(western blot)检测KIT-dimer的表达，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡，从而了解KITMAb是否对KIT蛋白的二聚化能够有效抑制，在细胞水平对KITMAb进行初步筛选。
　　 结果
　　 1、KIT-dimer在GIST中的表达：Native-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(western blot)检测49例新鲜GIST组织，发现15例标本KIT-dimer表达阳性，在分子量为170KD以上处可见清晰阳性条带；49例标本经Native-PAGE及SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)检测均可见KIT-monomer阳性表达，阳性条带位于分子量145/125KD处。
　　 2、KIT-dimer表达与GIST临床病理因素的关系：表达KIT-dimer的病例组平均发病年龄59.21±13.84岁，而不表达KIT-dimer病例组为61.27±12.61岁，略晚于KIT-dimer阳性病例组，但经统计学分析无明显差异(t=-0.497，P=0.621)。KIT-dimer在28例男性GIST病例中表达率为29％，在女性GIST病例中的表达率为33％，经卡方检验KIT-dimer的表达与患者的性别无明显相关性(x2=0.128，P=0.480)。49例病例中，发病部位为胃34例，小肠11例，大肠1例、直肠1例、大网膜1例和腹腔1例，经统计学分析，KIT-dimer的表达与肿瘤发生部位无明显相关(x2=1.398，P=0.208)；根据2008年NIH提出的GIST危险度分级，所检测的病例有非高危24例，高危25例，KIT-dimer在非高危和高危病例中的表达率分别为17％和44％，有统计学意义(x2=4.307，P=0.038)；15例KIT-dimer表达阳性病例中，肿瘤平均最大径为12.27±8.29cm，高于不表达KIT-dimer的病例组的平均最大径5.88±3.81cm，有统计学意义(t=3.723，P＜0.01)；经卡方检验，KIT-dimer阳性病例中的每50个高倍视野中细胞核分裂数较KIT-dimer阴性病例增多(x2=9.726，P=0.040)；表达KIT-dimer病例组的Ki-67增殖指数也明显高于KIT-dimer阴性病例(x2=4.497，P=0.041)。
　　 3、c-kit基因突变分析及其与KIT-dimer表达的相关性分析：PCR扩增GIST组织中C-kit基因，将PCR产物进行DNA测序，49例标本中成功测序48例，其中35例c-kit基因发生突变：外显子11突变29例，c-kit外显子11的框内缺失突变发生率为69.0％，插入突变发生率为13.8％，发生缺失和插入突变位于密码子550～580之间，点突变发生率为17.2％，突变位点在密码子557、559或560。外显子9突变6例，突变类型均为编码Ala502～Try503核苷酸的复制插入突变。其余13例未检测出c-kit外显子9及11的突变。结合KIT-dimer表达情况，McNemar统计学分析表明，KIT-dimer表达与c-kit基因的突变状态无明显相关性(x2=0.432，P=0.373)，KIT-dimer的表达与c-kit外显子突变位点也无明显相关(x2=0.503，P=0.436)。
　　 4、KIT-dimer表达与SCF表达的相关性分析：免疫组化检测49例GIST组织，其中35例组织中SCF表达阳性，表达率为71％(35/49)，在所有的阳性病例中，SCF表达均位于肿瘤细胞的胞膜或/和胞浆；KIT蛋白在所检病例中的表达率高达98％(48/49)；其中有34例组织存在SCF和KIT蛋白的共表达，其共表达率为69％(34/49)。KIT-dimer在SCF阳性的病例中的表达率为31％(11/35)，在SCF阴性的病例中的表达率为29％(4/14)，结合SCF表达情况，McNemar统计学分析表明，KIT-dimer表达与SCF表达无明显相关性(x2=0.380,P=0.566)。
　　 5、KITMAb的制备、筛选及其靶向阻断作用的研究：成功制备11株KITMAb，经SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)及免疫组织化学的方法筛选出6株组织学定位及分子量准确的KITMAb；三株稳转细胞抽提蛋白经Native-PAGE、SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)检测结果显示转染了野生型pcDNA3.1-c-kit的W细胞及突变型野生型pcDNA3.1-c-kit的M细胞均有KIT-monomer表达，转染pcDNA3.1空质粒的P细胞无KIT-monomer表达，仅M细胞有KIT-dimer表达，并且细胞生长曲线显示M细胞较之W细胞及P细胞生长速度加快，提示细胞转染成功。给予不同浓度的1-Ab、3-Ab、4-Ab、6-Ab、7-Ab及8-Ab6株KITMAb与三株稳转细胞共孵育96h后，MTT法检测KITMAb对三株细胞增殖作用的影响，结果显示：与阴性对照(未加抗体)组比较，1ul/ml的KITMAb对W细胞有抑制作用，4-Ab、6-Ab、7-Ab及8-Ab对M细胞有抑制作用，P细胞无明显变化，但三株细胞经组间方差分析均无统计学差异(W：P=0.080,F=2.429；M：P=0.066，F=2.605；P：P=0.120,F=2.093)；结合前期SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)及免疫组织化学初筛结果，挑选其中4-Ab、6-Ab、7-Ab及8-Ab4株KITMAb，并调整浓度为2ul/ml，与KITMAb共孵育的各组W细胞及M细胞均出现增殖受抑，P细胞无明显变化，但经组间方差分析均无统计学意义(W：P=0.575，F=0.759；M：P=0.544，F=0.814；P：P=0.889，F=0.272)；MTT检测结果显示虽然KITMAb在第96小时已经开始对W细胞及M细胞增殖有抑制作用，但抑制增殖作用不显著，且挑选出的4株KITMAb之间无明显差异。调整KITMAb浓度为5ug/ml，第8天MTT结果显示4株KITMAb对P细胞、W细胞的增殖无明显抑制作用(P：P=0.154，F=2.111；W：P=0.477，F=0.752)，M细胞增殖受抑，经方差分析有统计学意义(P=0.024，F=4.516)，并经多重样本间LSD-t检验分析发现，4-Ab、6-Ab、8-Ab可以显著抑制因KIT蛋白活化而导致的细胞增殖加快(4-Abvs阴性对照组：P=0.010,LSD-t=0.290；6-Abvs阴性对照组：P＜0.01，LSD-t=0.330；8-Abvs阴性对照组：P=0.022，LSD-t=0.250)。进一步验证KITMAb在细胞水平对KIT受体二聚化的阻断作用，将M细胞与4株不同KITMAb(5ul/ml)共同孵育72h，并以加入1uM的临床治疗剂量的imatinib作为阳性对照，Naitve-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)检测结果显示加入4-Ab和6-Ab的KIT-dimer的表达受抑；同时细胞周期检测结果显示：与阴性对照组相比，阳性对照组及四组实验组处于增殖期细胞比例降低，但经方差分析无统计学意义(P=0.246，F=1.552)；细胞凋亡检测结果显示：与阴性对照组相比，阳性对照组及四组实验组细胞凋亡增多(P＜0.01，F=35.642)，进一步经多重样本间LSD-t检验4-Ab、6-Ab和imatinib与阴性对照组间有差异(4-Abvs阴性对照组：P＜0.01，LSD-t=-0.539；6-Abvs阴性对照组：P＜0.01，LSD-t=-1.353；imavs阴性对照组：P=0.037，LSD-t=-0.292)。
　　 结论
　　 1、本研究通过比较Native-PAGE和SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)法对GIST组织蛋白的检测，利用Native-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹法成功检测出GIST组织中存在的KIT-dimer蛋白，建立了一种用于检测KIT-dimer蛋白的方法。
　　 2、与KIT-dimer表达阴性的GIST相比，KIT-dimer表达阳性的GIST肿瘤直径较大，细胞核分裂数及Ki-67指数等肿瘤增殖相关指标均呈增强或增高趋势，肿瘤危险度分级更倾向高危。提示：KIT-dimer的表达可能与GIST细胞的增殖相关并可作为判断GIST预后的一项检测指标。
　　 3、KIT-dimer表达与c-kit基因是否突变及突变位点和类型之间均无明显相关性，KIT-dimer表达与SCF表达之间也无明显相关性。提示：在GIST中，配体依赖的KIT/SCF通路可能是除配体非依赖通路之外的KIT蛋白的另一条独立有效的激活途径。
　　 4、成功制备了一组能与KIT受体二聚化功能域，即胞外第4、5结构域相结合的鼠源性KIT二聚化阻断单克隆抗体--KITMAb，并进一步利用Native-PAGE、SDS-PAGE凝胶电泳免疫蛋白印迹(westernblot)技术、免疫组织化学方法、MTT法及流式细胞仪完成KITMAb的初步筛选，初步筛选出阻断效果较为显著的4-KITMAb及6-KITMAb。