胰腺粘液性囊性肿瘤相关miRNAs筛选及细胞系构建的初步研究

摘要

背景：
　　 胰腺粘液性囊性肿瘤(mucinous cystic meoplasms of pancreas，MCNs)是一类具有潜在恶变倾向的良性肿瘤，早期手术切除治疗预后好、复发率低。病变一旦由胰腺粘液性囊腺瘤(mucinous cystadenoma of pancreas，MCA)进展为粘液性囊腺癌(mucinous cystadecarcinoma of pancreas，MCAC)阶段，即可能丧失手术时机，并且该疾病对放疗、化疗等治疗手段均不敏感。因此，准确判断疾病进程对患者预后具有重要意义。但目前关于MCNs的发病机制尚未完全阐明，且缺乏敏感性、特异性好的分子标记物判断肿瘤的良恶性。microRNAs(miRNAs)是一种内源性的长约19～25nt的非编码小RNAs，通过作用于下游mRNA的3'UTR区域，广泛参与体内多种生物学功能的调控。相关研究表明肝癌、胃癌、结肠癌、食管癌等消化道肿瘤中均具有差异表达的miRNAs；同时，在急、慢性胰腺炎(acute pancreatitis or chronic pancreatitis，APorCP)、胰腺导管内乳头状粘液瘤(interductal pillirary neoplasms，IPMN)、胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)、胰腺癌(pancreatic cancer，PC)等胰腺良恶性疾病中，也有差异表达的miRNAs发挥重要的生物学功能。据此，我们对MCNs的相关miRNAs表达谱进行研究，筛选差异表达的miRNAs，验证并分析预测相应的靶基因，探索其在MCNs发病中的作用，为揭示MCNs发病机制、寻找疾病早期诊断标志物提供理论依据。
　　 目的：
　　 筛选胰腺粘液性囊性肿瘤(MCNs)差异表达的miRNAs，寻找受其调控的靶基因，并摸索构建MCNs细胞系的培养条件。
　　 方法：
　　 1.收集2011年5月至2011年12月我院普外科术后病理确诊为MCNs的肿瘤组织样本，同时收集相应瘤旁组织作为对照，抽提miRNAs质检后进行表达谱芯片筛选。
　　 2.采用Taqman探针RT-PCR检测法对芯片筛选发现的差异表达显著的miRNAs进行验证。
　　 3.利用预测网站miRGEN(包含Targetscan、picTAR、miRanda)等对验证后的miRNAs进行靶基因预测及相关功能分析。
　　 4.外植块法、酶消化法、裸鼠接种法接种新鲜组织标本探索MCNs原代细胞培养条件，观察细胞形态并利用免疫组化的方法初步鉴定其细胞来源。
　　 结果：
　　 1.在收集到的9例标本中，3例配对组织达到miRNAs芯片质检合格标准，筛选出miR-192、miR-197、miR-224、miR-375四项差异表达基因。结果显示，miR-192上调3.31倍，余者均下调，分别为0.43、0.34、0.36倍。
　　 2.经RT-PCR法验证miR-192上调2.143倍，miR-197下调0.47倍，miR-224下调0.26倍，miR-375下调0.60倍，检测结果与芯片筛选结果基本一致。
　　 3.经生物信息学预测以上4项miRNAs的靶基因各有上千条，对各项miRNAs进行Kegg信号通路、GO功能注释等信息整合后，选取miR-224进一步分析其功能，拟定候选靶基因为Jagged1、L1CAM、SMAD4，分析结果提示miR-224与相应候选靶基因表达水平呈负相关。
　　 4.采用胶原酶V酶消化法可使细胞成功贴壁生长，上皮样细胞与成纤维样细胞混杂，上皮样细胞形态呈多角形，铺路石样生长。免疫组织化学染色结果显示上皮标记CK广谱角蛋白阳性。
　　 结论：
　　 1.胰腺粘液性囊性肿瘤相关miRNAs涉及miR-192、miR-197、miR-224和miR-375。
　　 2.胰腺粘液性囊性肿瘤相关miR-224靶基因可能涉及Jagged1、L1CAM、SMAD4。
　　 3.胶原酶V酶消化法可用于MCNs原代细胞培养。