发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用及其延迟毒性效应

摘要

背景和目的
　　 近年来，水母爆发和水母蜇伤事件日益频繁，给海滨旅游业、近海渔业及水下作业带来极大的危害，全世界每年被水母蛰伤的患者数以十万计，死者不在少数。水母蜇伤后绝大部分情况下会产生皮肤瘙痒、刺痛、红肿等局部症状，严重时可以导致呼吸、循环衰竭甚至死亡。
　　 水母毒素是一类肽类毒素，具有溶血、神经、肌肉、呼吸、循环以及皮肤坏死等多种生物毒性。心血管毒性是水母蜇伤的主要毒性之一，被认为是水母蜇伤致死的主要原因。水母毒素研究从20世纪60年代起在水母危害最严重的澳大利亚就已经受到关注和重视，研究发现Chironex fleckeri、Chrysaora quinquecirrha、Chiropsalmus quadrigatus等从水母触手中提取的刺丝囊毒素(nematocyst venom，NV)含有强烈的心血管毒性。由于NV含量极少，在提取和使用过程中其心血管毒性丧失明显，而各实验室毒素提取方法又各不相同，导致实验研究结果差异很大，甚至有相互矛盾之处。本实验室前期研究发现发形霞水母(Cyanea capillata)触手提取物(tentacle-only extract，TOE)与NV都具有明显的心脏毒性和细胞毒性，实验中用易于获得的TOE代替NV对水母毒素研究具有重要促进作用。
　　 前期研究表明，C.capillata TOE对麻醉大鼠产生一个轻度而短暂的升血压反应后伴随剧烈的血压下降，直至循环衰竭而死亡。但TOE所引起的心血管毒性主要是全身神经体液调节的结果还是直接作用于心脏所致，仅在整体动物实验的研究层面，难以明确回答，且目前缺少水母毒素对离体心脏的影响及其机理的系统研究。因此，本课题第一部分采用Langendorff离体心脏灌注模型，尽量排除神经体液因素的影响，研究C.capillata TOE对大鼠离体心脏的影响。
　　 另外，本实验室前期研究发现小鼠尾静脉注射TOE研究其半数致死剂量LD50过程中，通过血生化指标及血气分析结果，发现数分钟至2h内急性死亡的小鼠死因主要是急性心脏或神经相关毒性；而2h至2天内死亡的小鼠因除心脏受到毒素损伤外，肝肾也明显受损，其死因目前尚不明确。因此，相对于数分钟至2h内水母毒素所致的以心血管毒性、神经毒性等为主的急性毒性反应，2h～48h内由水母毒素引发的以全身性多器官损伤为主的一系列临床表现，我们称之为水母蜇伤迟发综合征或者水母毒素延迟毒性综合征。水母毒素延迟毒性作用机理未见报道，而这种研究相对于水母急性毒性更具有临床实际意义，因多数临床上的水母蜇伤患者急性致死者的较少见，多数的受伤中毒者仪发生局部反应，但也有部分中毒者由于救治的时机的延误或者致伤水母不同、中毒剂量不同可能发生水母蜇伤迟发综合征。因此，本课题第二部分拟通过建立TOE延迟毒性作用模型，研究水母毒素延迟毒性的效应及作用机理。
　　 研究方法
　　 第一部分：TOE对离体心脏作用。提取C.capillata TOE样品，并用KH液(pH7.35～7.45)透析。麻醉大鼠，开胸取心并悬挂于离体心脏灌流系统，左心室插入球囊以记录左心室压，侧管推注给予不同剂量TOE，观察30min，全程监测HR、LNDP、INEDP、dp/dt以及CF等指标，连接心电导联记录大鼠离体心脏ECG，分析TOE对大鼠离体心脏心功能以及心脏传导系统的影响。取TOE作用后的大鼠离体心脏，4％甲醛固定，常规病理检查；取TOE作用后的大鼠离体心脏，4％多聚甲醛固定，透射电镜观察TOE对心肌的影响。按上述方法分离、提取C.capillata TOE样品，采用碱变性以及缓冲液更换等方法制备去除溶血组分的TOE。使用前采用KH液(pH7.35～7.45)透析。麻醉大鼠，开胸取心并悬挂于离体心脏灌流系统，左心室插入球囊以记录左心室压，侧管推注去溶血组分的TOE 0.3mg，观察30min，全程监测HR、LVDP、LVEDP、dp/dt以及CF等指标，连接心电导联记录大鼠离体心脏ECG。取TOE作用后的SD大鼠离体心脏，4％甲醛固定，常规病理检查及透射电镜观察TOE对心肌的影响。分析TOE与去溶血组分的TOE对大鼠离体心脏影响的异同。
　　 第二部分：TOE的延迟毒性作用机理。将大鼠放入ALC-HTP动物恒温固定器内，露出鼠尾，测定尾动脉收缩压(Systolic blood pressures，SBP)。在测量前，利用恒温系统加热2-5min，温度设置在33-34℃使大鼠尾动脉充分扩张，易于信号传导。通过大鼠尾静脉注入0.2mL/100g的TOE，浓度分别为0μg/kg，90μg/kg，180μg/kg，360μg/kg，540μg/kg以及实验对照(360μg/kg的TOE经煮沸10min灭活)。记录注射TOE后0.2h，2h，4h，6h，8h和10h的SBP，持续观察10h，并记录死亡时间。注射TOE10h后，将大鼠以25％乌拉坦腹腔麻醉(1.0mg/kg)后，取腹主动脉血液检测血生化指标。检测指标包括血常规，肝功能指标(TP、ALB、Glob、A/G、ALT、AST、LDH)，肾功能指标(Urea、Crea)，心肌酶谱(CK、CK-MB)，血电解质(Na+、K+、Ca2+和Cl-)。取空白对照组及高剂量组心、肺、肝及肾等器官，常规病理检查和透射电镜观察，同时采用TUNEL检测细胞凋亡情况。
　　 结果
　　 第一部分：TOE对大鼠离体心脏作用。给予TOE后，SD大鼠离体心脏HR、LVDP、dp/dt及CF各项心功能指数呈剂量依赖性下降，而LVEDP则呈剂量依赖性上升。病理学检查显示部分心肌纤维变性。透射电镜显示部分心肌纤维断裂、溶解、消失，线粒体发生肿胀，少量线粒体内部脊结构不清晰，遭到破坏。生化分析显示LDH、AST、CK、CK-MB等酶指标显著升高，提示心肌细胞受到破坏。此外，由导出的ECG发现，TOE能够诱发离体心脏的心律失常，并具有剂量依赖性，当TOE0.5mg时，可诱发Ⅲ度房室传导阻滞。
　　 经过碱变性、缓冲液透析，得到去除溶血活性的TOE组分，去溶血活性的TOE组分相对于TOE对离体心脏心电图影响并不明显，却仍然能够使HR、LVDP、dp/dt及CF各项心功能指数呈剂量依赖性下降，LVEDP呈剂量依赖性上升，但作用均较TOE轻微。病理学检查发现，去溶血组分TOE作用过的离体心脏，可见心肌纤维变性。
　　 第二部分：TOE的延迟毒性作用机理。在给予不同剂量(90μg/kg、180μg/kg、360μg/kg)的TOE后，观察10h内TOE对大鼠无创尾动脉压影响。在给予最高的剂量(540μg/kg)后，三个剂量组的大鼠均存活，各剂量组的的大鼠尾动脉收缩压(SBP)同对照组(360μg/kg的TOE经煮沸灭活后)相比，高、中、低三个剂量组SBP均呈现先升高，后降低的过程，且呈剂量依赖性。
　　 各脏器损伤程度随TOE剂量的增加而加重，且呈现剂量依赖性。在给予TOE10h后，在各剂量组中，肝肾功能相关生化指标及酶学指标变化均提示肝肾功能受损。心肌损伤酶学指标只在高剂量组呈现明显上升。血电解质指标中K+浓度升高和Cl-浓度下降在中高剂量组呈现出显著变化，而Ca2+浓度升高而Na+浓度下降则只在高剂量组表现出明显差异。
　　 病理结果显示肝肾损伤随TOE剂量增加而加重，在中高剂量组以肝细胞大片坏死，肾小管上皮细胞坏死脱落，管腔内充满大量坏死细胞碎片和透明管型。心脏损伤相对较轻，主要是心肌细胞变性，心肌纤维扭曲，并伴有间质水肿。除部分肺泡腔内可见散在出血及轻微的组织液渗出，肺脏无明显损伤。
　　 在TUNEL和透射电镜检测中，可见肝肾组织内大量的细胞凋亡和细胞内损伤；心脏组织内没有观察到明显凋亡细胞，而细胞内损伤相对肝。肾组织较轻；肺脏只有局部凋亡细胞。
　　 结论
　　 C.capillata TOE具有心脏毒性，可直接作用于心脏的心肌及传导系统，而水母毒素中，溶血活性等其他活性组分在TOE心脏毒性效应的发挥中起重要辅助作用。当TOE剂量为0.1mg、0.2mg时，可导致离体心脏心功能下降，但会有一定程度的恢复：然而，当TOE剂量达到0.3mg及以上时，心功能发生不可恢复的下降。此外，TOE可导致心肌纤维溶解、断裂，线粒体肿胀等病理性变化，相关心肌酶谱分析也显示心肌细胞受到了一定程度的损伤。TOE对心脏的传导系统也具有毒性作用，可诱发不同程度的心律失常，并具有剂量依赖性。当TOE剂量达到0.5mg时，可诱发Ⅲ度房室传导阻滞。
　　 通过给予大鼠尾静脉注入不同剂量的发形霞水母触手提取物(TOE)，成功模拟了水母毒素延迟毒性综合征的动物模型，可以观察到明显的剂量依赖性反应。综合病理及TUNEL等各项实验结果，可得出水母毒素延迟毒性主要引发严重的肝、肾损伤，而心肺损伤相对较轻。这同以心脏毒性、神经毒性为主要表现的急性毒性作用之间存在明显的差异。可能原因主要是毒素剂量的差别。即大剂量水母毒素中毒后，在开始的几个小时内可出现循环系统塌陷、心脏骤停甚至死亡或者通过中枢神经系统作用，导致呼吸困难甚至骤停。然而，低剂量的毒素则在数小时后可能导致肝细胞坏死引发的急性肝脏功能衰竭或者肾小管细胞坏死引发的急性肾功能衰竭。
　　 在上述实验中，在给予TOE后相当时间内(0.2～4h)产生一个明显的升血压效应，其中一个可能原因是经部分研究证实的水母毒素引起的缩血管效应，也可能是水母毒素的细胞毒性作用所导致。
　　 总之，水母毒素多种毒性的综合作用可能是多器官损伤为主要表现的延迟毒性综合征的主要原因，具体机制仍有待进一步研究。