富氢水对大鼠急性-氧化碳中毒脑损伤保护作用及其机制研究

摘要

一氧化碳(carbonmonoxideCO)中毒是一种常见的中毒性疾病，严重危害着人类的健康和生命。部分重度中毒患者常因累及大脑、心脏等多个重要脏器，即使挽救了生命，也常留下迟发性神经精神后遗症，严重影响了生存者的生活质量，给家庭和社会带来了巨大的负担。因此，如何尽早对急性CO中毒脑损伤采取有效治疗手段并防治迟发性中毒后脑病(DelayedneurologicsequelaeDNS)，已经成为临床上迫切需要解决的问题。
　　 自由基损伤是急性CO中毒脑损伤的主要发病机制。自由基与人类的健康和疾病密切相关，是当前生命科学研究的热点。过量产生的自由基会导致DNA、脂质和蛋白的氧化损伤，其中羟自由基(.OH)和过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)毒性强，目前为止还没有在哺乳动物体内发现内源性的有针对性的清除方式。2007年，有学者在《Naturemedicine》报道，动物呼吸2％的氢就可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤。
　　 本课题采用吸入法建立大鼠急性CO中毒脑损伤模型，该模型为CO中毒的常用模型，大鼠与人类的大脑结构相似，能很好地模拟人脑缺血缺氧的过程。观察氢饱和的生理盐水(简称为富氢水)对急性CO中毒脑损伤大鼠的保护效应，通过症状学、病理学、形态学、行为学等不同指标分别评价富氢水对皮层区以及海马区的保护效应。并从两方面探讨富氢水对急性CO中毒脑损伤保护作用的机制：(1)富氢水治疗对大鼠急性CO中毒后氧自由基及相关抗氧化酶的作用。主要观察急性CO中毒后腹腔注射富氢水，大鼠大脑皮层和海马的氧化应激系统的变化；(2)急性CO中毒后予以富氢水治疗对大鼠神经元细胞凋亡的影响，并测定凋亡酶活性和凋亡相关蛋白变化。通过本课题的实施，旨在为富氢水用于临床治疗急性CO中毒脑损伤提供实验依据。
　　 一、富氢水对大鼠急性CO中毒脑损伤的保护效应
　　 目的：研究腹腔注射富氢水对大鼠急性CO中毒脑损伤是否具有保护效应；同时分别观察皮层和海马对富氢水治疗的反应。
　　 方法：采用吸入法制作急性CO中毒模型，腹腔注射富氢水治疗。动物分为正常对照组(Control)、CO+生理盐水(NS)组、CO+富氢水(Hydrogen)组。造模后24小时观察各组动物的一般精神行为状态、体重变化，14天生存情况，根据Brailowsky描述的神经学评分方法对神经功能缺损进行症状评估，测定脑组织含水量，采用脑组织灌流切片，行HE、NISSL染色，并在镜下对神经细胞进行计数。观察建模后存活14天大鼠的水迷宫实验，评价其空间记忆能力。
　　 结果：富氢水治疗组的动物在建模后24小时精神状态较好，毛色光滑，较为活泼，反应迅速，主动摄入食水，体重下降不明显，其结果明显优于生理盐水组(14.17±3.76gvs.18.5±2.43g；P<0.05)；富氢水治疗组的生存率明显增高(80％vs.60％；P<0.05)；神经功能缺失症状减轻明显(13.83±1.94vs.16.83±1.72；P<0.05)；脑组织水含量低(0.79±0.04vs.0.88±0.04；P<0.01)。HE和NISSL染色均表明富氢水对皮层(NISSL：88.50±22.88vs.58.67±16.18；P<0.05)和海马(NISSL：102.83±26.36vs.51.67±16.79，P<0.01)有明显的保护作用。2周后水迷宫测试提示富氢水治疗组逃避潜伏期短于生理盐水组(22.67±4.03vs.32.33±4.59，P<0.05)。
　　 结论：1、吸入法模拟急性CO中毒模型制作方法相对简单，重复性好，能比较好地应用于观察动物急性CO中毒后各项指标的变化以及干预措施的疗效比较；2、富氢水注射对大鼠急性CO中毒脑损伤有保护作用。
　　 二、富氢水通过调节氧化应激系统对大鼠急性CO中毒脑损伤的保护作用
　　 目的：研究富氢水的保护效应是否与清除氧自由基、上调抗氧化酶的活性有关。
　　 方法：按照第一部分的方法进行建模和治疗。对大鼠皮层和海马分别取材，制作组织匀浆，根据试剂盒说明用硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量，酶联免疫吸附测试法(ELISA)测定8-羟基鸟嘌呤(8-OHdG)含量，羟胺法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力，比色法测定脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活力。
　　 结果：CO中毒后24小时，与生理盐水组相比，富氢水能降低皮层(1.42±0.44vs.2.04±0.44，P<0.05)和海马(1.91±0.68vs.3.17±0.69，P<0.01)的MDA含量；降低8-OHdG的含量(皮层54.64±4.93vs.62.98±9.08，P<0.05)；海马60.43±10.49vs.82.66±12.55，P<0.01)；增强抗氧化酶的活性，如SOD(皮层111.35±44.95vs.46.23±28.78，P<0.05；海马173.08±51.43vs.89.11±35.38，P<0.01)，但对GSH-px影响不明显(皮层5.41±1.41vs.5.25±0.89，P>0.05；海马6.19±2.67vs.5.87±2.38，P>0.05)。
　　 结论：1、大脑皮层和海马对急性CO中毒均有明显的氧化应激反应；2、富氢水的保护作用可能是通过上调内源性抗氧化酶、清除氧自由基发挥作用。
　　 三、富氢水通过抑制过度凋亡对急性CO中毒脑损伤的保护作用
　　 目的：研究富氢水的保护效应是否与抑制神经细胞过度凋亡有关。
　　 方法：按照第一部分的方法进行建模和治疗。采用TUNEL法检测细胞凋亡；ELISA法检测caspase-3和caspase-9的酶活性；WesternBlot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达。
　　 结果：CO中毒后24小时，与生理盐水组相比，富氢水能明显减少皮层(57.67±7.58vs.99.50±8.73，P<0.01)和海马区(52.33±13.17vs.82.17±15.79)的凋亡阳性细胞数；降低皮层和海马的caspase-3酶(皮层0.029±0.008vs.0.065±0.009，P<0.01vs.CO+NSgroup；海马0.031±0.004vs.0.053±0.007，P<0.01)和caspase-9酶(皮层1.196±0.384vs.1.797±0.432，P<0.01；海马1.208±0.112vs.1.897±0.280,P<0.01)相对活性；也提高了Bcl-2在皮层以及海马(皮层1.363±0.183vs.0.886±0.070,P<0.01；海马1.166±0.139vs.0.807±0.067，P<0.01)的表达，但对Bax水平影响不明显(皮层0.515±0.038vs.0.494±0.029，P>0.05；海马0.437±0.107vs.0.410±0.034，P>0.05)。
　　 结论：1、急性CO中毒后，大鼠大脑皮层和海马均呈现不同程度的凋亡；2、抑制凋亡可能是富氢水保护作用机制之一。