腺相关病毒载体大规模生产系统的建立及其机制研究

摘要

腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是一种非致病性基因治疗病毒载体。流行病学研究发现80％的人群感染过AAV病毒而至今尚未发现任何跟AAV相关的疾病。重组AAV载体(rAAV)删除了全部病毒基因组，只保留了两端具有调控作用的反向末端重复序列(InvertedTerminalRepeats，ITR)，因而使其具有更好的安全性。另外，AAV属于细小病毒科，其病毒颗粒非常小，物理性质稳定，容易存储而不易失活，因而具备生物制品成药的优势特征。AAV病毒载体在在许多疾病的治疗中都展现出了很好的效果，2009年Science评选的“十大科技进展”中就有AAV在治疗黑朦症上获得的巨大成功。NewEnglJMed报道用AAV治疗先天性失明的黑朦症患者，治疗者即恢复了视觉，可像正常人一样做体育运动，且在后期临床追踪中未有任何严重不良反应。Nature、NatMed等杂志也多次报道用AAV表达抗体治疗HIV，可完全消除小鼠和猴子体内的HIV病毒。除此之外，AAV在神经系统疾病、代谢疾病以及肿瘤等应用中都有着较好的表现。因而，AAV作为疾病治疗的运输载体越来越受到全世界的广泛关注。
　　 全世界当前利用AAV正在进行39项临床试验，其中28项在美国，7项在欧洲，2项在中东地区，印度和非洲各有1项。而在南美洲、澳洲以及其他科技发达地区如加拿大、新加坡、日本等许多地方都还没有开展相关的临床试验。限制AAV在其他地区开展临床试验的一个非常重要的因素就是AAV病毒包装难度较大，尤其是受限于大规模生产，使得AAV在大型动物实验以及临床试验上的应用一直难以开展，即便是在美国也还没有关于AAV大规模生产的一个标准方案。因而，建立AAV大规模生产技术对于加速AAV载体的应用研究和占据相关领域研究的制高点具有非常重要的意义。传统AAV生产是用三质粒共转染HEK293细胞，如果要生产出1014vg的病毒，就需要反复转染共达5000多个175cm2的Flask培养瓶，这对于操作技术以及人力物力上而言都是极大的限制。为此，国际上一直在寻求能够大量生产AAV的方式，建立了包括Ad/AAV，HSV/AAV，生产细胞株以及昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统在内的多种生产方式。其中，昆虫细胞杆-状病毒表达载体系统(InsectCell-BaculovirusExpressionVectorSystem，IC-BEVS)生产AAV在近些年引起了广泛的关注，是一种非常有潜力的生产系统。虽然在哺乳动物细胞中生产AAV已经广泛研究，但是昆虫细胞中AAV包装组份的定位和相互作用几乎一无所知，这些定位和相互作用是其基因组复制、外壳组装和基因组包装的关键。本研究着重建立基于昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统的大规模可线性放大的AAV新颖生产和纯化技术，并在此基础上首次对1，2，8，9四种血清型AAV病毒在昆虫细胞中的重组过程进行系统化的动态对比研究。
　　 第一部分：基于IC-BEV系统的腺相关病毒生产体系的建立
　　 目的：构建基于pFBD骨架载体的包装AAV所需的重组杆状病毒载体，重组生产1，2，8，9型AAV。
　　 方法：(1)以pFBD载体为骨架，构建携带有AAV2的Rep基因以及各血清型Cap基因的重组杆状病毒转移载体pABP1，2，8或9，在Rep基因及Cap基因的特定位点引入Intron-ph启动子以启动Rep和Cap基因在昆虫细胞中的表达；(2)以pFBD载体为骨架，构建携带有AAV2ITR表达框的重组杆状病毒转移载体pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794；(3)将上述pABP1，2，8，9以及pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794总共六个载体分别与DH10BacTM细菌转座重组，蓝白斑筛选出相应的重组杆状病毒载体pABPM1，2，8，9以及pABVNM-hCMV-EGFP和pABVNM-hCMV-H794；(4)包装重组杆状病毒ABPM1，2，8，9以及ABVNM-hCMV-EGFP和ABVNM-hCMV-H794；(5)重组杆状病毒ABPM1，2，8，9分别与ABVNM-hCMV-EGFP或ABVNM-hCMV-H794两两重组生产rAAV1-hCMV-EGFP或H794，rAAV2-hCMV-EGFP或H794，rAAV8-hCMV-EGFP或H794，rAAV9-hCMV-EGFP或H794；(6)RT-PCR检测相应的病毒滴度，WesternBlot检测Rep和Cap蛋白的表达，细胞实验验证rAAV的功能。
　　 结果：成功构建了pABP1，2，8，9以及pABVN-hCMV-EGFP和pABVN-hCMV-H794载体，并通过转座重组及病毒包装获得相应的重组杆状病毒；成功重组出1，2，8，9四型AAV病毒；RT-PCR、WesternBlot以及细胞感染实验分别成功测定了病毒滴度、蛋白表达和验证了病毒功能。
　　 结论：成功建立以昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(IC-BEVS)为基础腺相关病毒生产体系。
　　 第二部分：腺相关病毒载体的大规模生产、纯化及鉴定
　　 目的：在已建立基于IC-BEV系统的腺相关病毒生产体系的基础上，放大AAV生产规模，建立相适应的可线性放大的大规模生产和纯化技术，并建立对应的病毒鉴定和评价体系。
　　 方法：采用BD公司的500mlFalcon培养瓶在恒温培养振荡器中重组生产rAAV1，2，8和9，比较研究多种细胞裂解方案、缓冲液体系、离子浓度以及层析缓冲液pH值等条件并进行优化，通过AKTAPurifier10蛋白纯化仪用AVB亲和层析柱分离纯化rAAV，并通过RT-PCR测定滴度、SilverStaining测定纯度、透射电镜观察计算病毒实心颗粒与空壳颗粒的比例，细胞试验验证纯化病毒的功能。
　　 结果：建立了基于IC-BEVs系统的AAV大规模生产和纯化技术，目前优化的条件适合于rAAv1，2和8的分离纯化，每100ml培养体系可生产高达1013VG的病毒，单次生产即可获得1014VG的产量，相比传统方式需转染5000个175cm2瓶子的细胞大大提高了效率，得到的病毒纯度超过95％，实心病毒颗粒占85％左右，病毒具有较好的感染能力。
　　 结论：我们建立基于IC-BEVS的AAV大规模生产和纯化技术从产量和纯度上评价都达到了世界先进水平，为AAV产业化生产和应用AAV开展相关的研究奠定了基础。9型AAV的纯化条件还需进一步探索。
　　 第三部分：IC-BEV系统中生产AAV时的动态机制研究
　　 目的：哺乳动物细胞中生产AAV已经得到广泛深入的研究，但是AAV在昆虫细胞中的包装生产过程几乎一无所知。我们首次系统的比较研究了rAAV1，2，8，9四种血清型AAV病毒在昆虫细胞中组装的动态机制，为进一步深入理解和优化基于IC-BEVS的AAV大规模生产和纯化技术提供线索。
　　 方法：用抗Rep蛋白，抗各型Cap蛋白，抗rAAV1和rAAV2整个病毒颗粒以及抗杆状病毒表面糖蛋白gp64的抗体，分别于12，24，48，72和96小时通过免疫荧光技术研究在昆虫细胞中组装AAV病毒时各组分的动态作用机制。同时，通过透射电镜观察昆虫细胞中重组生产AAV病毒时的细胞结构变化。
　　 结果：在昆虫细胞中Rep蛋白表达后迅速进入核内，随时间推进浓度逐渐提高并呈簇分布，Cap蛋白表达后的入核速度相比而言要慢些，但最终也进入核内并与Rep蛋白的分布密切相关，其中2型和9型Cap与Rep蛋白的相互作用更为明显。各型AAV在核内组装，组装部位与杆状病毒基质以及纤维结构密切相关，组装的AAV主要分布在核周的环区，环区也是大量杆状病毒积聚的地方，免疫荧光显示Rep和Cap蛋白在此处发生相互作用。
　　 结论：Rep蛋白和Cap蛋白于杆状病毒特有的病毒基质外的环区组装成rAAV，Rep蛋白与各型Cap蛋白之间可能存在相互作用，杆状病毒与纤维结构以及AAV颗粒的分布密切相关。AAV在Sf9细胞中的组装部位似乎不在哺乳动物细胞中报道的核仁区域。Rep、Cap以及AAV和杆状病毒等在Sf9细胞中的精细作用机制还需要进一步的研究来确证。
　　 综上所述，我们成功建立了基于IC-BEVS的多血清型AAV的大规模生产和纯化技术平台，其产量(1013VG/100ml培养细胞)和纯度(95％)都达到了世界上研究AAV的顶尖实验室共同制定的金标准；我们首次对rAAV1，2，8，9在Sf9细胞中包装的动态机制做了探索，为深入理解和优化该系统奠定了基础；我们建立的技术平台也为应用AAV于各项临床实验突破了产量瓶颈，具有重要的理论研究和实际应用价值。