神经肽Y对巨噬细胞炎性因子和小分子炎症介质的调节及机制研究

摘要

近年来的研究表明，炎症反应在疾病谱中发病率和死亡率居前以及因病所致负担严重的慢性疾病的发生、发展过程中起重要作用，如恶性肿瘤、心脑血管疾病、代谢性疾病和神经退行性疾病等。机体对炎症反应的调控机制精确而又复杂，涉及神经、内分泌和免疫系统的共同参与和调节。神经(内分泌)-免疫网络在调节炎症以及维持机体内环境稳定的过程中发挥了重要的作用。
　　 神经肽Y(NeuropeptideY，NPY)是由36个氨基酸组成的多肽，1982年由瑞典的Karolinska学院的Tatemoto和Mutt从400kg猪脑组织中纯化出来的。NPY广泛分布于中枢和外周组织，尤以神经系统的含量为高。NPY在中枢的主要作用包括对学习、记忆、摄食、生殖内分泌等功能的影响。除了上述功能以外，NPY在哺乳动物免疫功能的调节方面以及在一些自身免疫性疾病发生发展中的作用也逐渐被揭示。在外周，交感神经是NPY释放的一大重要来源。有研究表明，外周交感神经广泛支配着外周免疫器官，在一些局部组织，出现了交感神经末梢和巨噬细胞形成的“类突触”样结构，这为NPY直接调节局部炎症以及巨噬细胞功能提供了生理解剖基础。
　　 巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成细胞，由外周血单核细胞分化而来，几乎分布于机体的各种组织中。活化的巨噬细胞通过分泌多种炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1以及大量炎性介质如白三烯、前列腺素、弹性蛋白酶、溶菌酶、尿激酶等，加强局部炎症反应。因此，在细胞和分子水平，明确NPY对巨噬细胞炎症因子和小分子炎性介质的调节作用和机制，是神经免疫调节方面研究亟待解决的问题。
　　 系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质、代谢物等)的构成，以及在特定条件下这些组分间相互关系的学科。代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是一种新的整体性的分析技术，它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化，反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化。因此，通过代谢组学技术，可以获得NPY作用下巨噬细胞小分子炎性介质的改变，明确其具体调节作用。蛋白质是生物体内功能的执行者，生物体结构和功能状态的改变必然在蛋白组水平上表现出来。通过液相色谱联合质谱鉴定可以获得关于蛋白质组的变化信息，并通过生物信息学分析和文献调研，寻找可能改变的信号通路或分子，为进一步阐述NPY的作用机理提供了高效的研究手段。
　　 本课题以小鼠巨噬细胞为研究对象。首先，采用LPS刺激巨噬细胞造成炎性激活模型。在此基础上，检测NPY对巨噬细胞主要炎性因子分泌的影响，并通过代谢组学技术，研究NPY对巨噬细胞小分子炎性介质分泌的影响。进一步，通过分别提取NPY作用下巨噬细胞胞核和胞浆部分的蛋白质组，应用纳升级二维液相色谱-串联质谱技术(2D-nano-LC-MS/MS)技术获得关于蛋白质组的变化信息，从中推测NPY的作用机制；针对蛋白质组学得出的结果以及NPY可能的信号通路，研究NPY炎性调节的分子机制，具体内容包括：
　　 1.本文首先建立了LPS刺激巨噬细胞造成的炎症模型，发现NPY能够抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，但是有趣的是，我们发现能够显著提高巨噬细胞晚期炎症因子HMGB1的分泌，而且该作用并非由于巨噬细胞坏死所导致的被动释放，而是巨噬细胞的主动分泌所致。通过mRNA水平的检测，我们发现NPY能够快速提高HMGB1mRNA的转录，其较LPS的提高mRNA水平的时间更快。接下来，我们应用代谢组学技术检测了LPS处理组合NPY+LPS处理组上清液中分子量小于1000的小分子代谢物的变化。主成分分析结果显示，NPY处理改变了炎症激活巨噬细胞的分泌模式。通过确认代谢产物类似分子离子后，我们发现NPY能够显著下调两种炎症介质脂氧素A4(0.53倍)和前列腺素B2(0.54倍)的分泌。本文的研究结果显示NPY能够显著抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，能够提高晚期炎症因子HMGB1的主动分泌和mRNA水平。并且能够改变炎症激活巨噬细胞的分泌模式，下调小分子炎症介质脂氧素A4(0.53倍)和前列腺素B2(0.54倍)的分泌。
　　 2.NPY能够调节巨噬细胞炎症因子和小分子炎性介质的分泌。为了探索其中的分子机制，我们采用了基于2D-nano-LC-MS/MS的高通量蛋白组学研究技术，研究RAW264.7细胞在10-8mol/L处理后，在胞内不同空间蛋白表达上呈现的差异，从而探索NPY炎性调节可能的信号途径。我们发现经过NPY处理后，RAW264.7细胞共有435个蛋白的表达呈现明显差异。这些蛋白涵盖了复杂的功能领域，包括能量代谢、细胞骨架、核酸代谢和炎症功能等。我们选取了跟炎症功能相关的蛋白进行探讨。最后我们发现，NPY可能通过改变其受体介导内吞过程中的连接分子β-arrestin2的空间分布发挥了炎症调节作用，影响了部分炎症因子的表达。并且从本实验可以看出，基于2D-nano-LC-MS/MS的蛋白组学技术是信号通路研究的有效手段。
　　 3.N-PY在巨噬细胞上主要通过Ⅰ型受体发挥作用，该受体属于Gq型蛋白耦联受体。目前关于NPY作用的分子机制罕有报道。我们结合第一部分研究观察到的炎性因子调节和第二部分的蛋白质组研究。我们推测NPY对TNF-α调节是由于NPY内吞过程中β-arrestin2分子向胞核转运过程相关。在细胞水平我们发现NPY作用下β-arrestin2分子向胞核转移。同时，我们发现NPY作用下，LPS引起的NF-κBp65亚基的入核量降低，说明NF-κB控制的炎症转录过程受到了抑制。