降钙素基因相关肽5247单核苷酸多态性(A/C)对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响

摘要

牙周炎是侵犯牙龈和牙周支持组织的慢性炎症性的破坏性疾病，它是引起牙齿缺失的主要原因之一。以前认为牙周炎的发病与进展主要受细菌及其他环境因素的影响与调节。最近，有充足的证据表明基因在该病的发病和进展中起着重要的作用。
　　 我们的前期研究发现：降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)阳性神经纤维广泛存在于牙周组织中，尤其是牙周炎的起始部位；牙周炎时，牙周组织中的CGRP阳性神经纤维显著增多，并向周围间质释放；一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖。
　　 另外国外有研究报道CGRP基因存在四个多态性位点，并且发现与帕金森氏病和精神病的发病有关。在以前一系列的研究中发现：CGRP+5247位点存在等位基因杂合子多态性现象；CGRP+5247位点单核苷酸多态性与广东人成人重度牙周炎有相关性。虽然目前对CGRP与牙周炎发生关系的研究很多，但是研究CGRP基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响仍需实验验证。
　　 本研究通过构建CGRP基因多态性重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞，进一步检测了CGRP多态性基因对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响，为进一步研究CGRP基因与牙周炎的关系提供了细胞学基础。
　　 第一部分：人牙周膜成纤维细胞的原代培养及检测
　　 目的：取材培养人牙周膜成纤维细胞并检测其组织胚胎学来源
　　 方法：离体牙取自长海医院门诊口腔科因正畸而拔出的双尖牙，年龄12-26岁，所选牙齿无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。采用酶消化+组织贴附的方法进行人牙周膜成纤维细胞原代培养，在原代细胞生长达到一定数量后，局部消化传代培养。对第4代细胞进行人牙周膜成纤维细胞的形态学观察和免疫组织化学鉴定(采用sABC法，进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色)。
　　 结果：原代培养出人牙周膜成纤维细胞，免疫荧光鉴定波形丝蛋白染色显示阳性，细胞角蛋白染色显示阴性。
　　 结论：成功原代培养出中胚层来源的人牙周膜成纤维细胞。
　　 第二部分：构建降钙素基因相关肽(CGRP)5247单核苷酸多态性(A/C)的重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞并测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化
　　 目的：制备与鉴定携带CGRP-A和CGRP-C的重组腺病毒并将CGRP-A，CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞
　　 方法：以计算机软件辅助设计引物扩增CGRP-A开放阅读框序列，通过重叠PCR点突变活动CGRP-C开放阅读框序列；分别将CGRP-A和CGRP-C插入pShuttle中构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C，经酶切线性化后采用电穿孔法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1一起转化到BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化后利用脂质体法将其转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒，观察细胞病变效应(CPE)现象，收集细胞反复冻融、裂解，获得高滴度重组腺病毒，通过酶切分析及PCR分析，鉴定重组腺病毒是否含有插入的目的序列。Ad-CGRP-A，Ad-CGRP-C重组腺病毒以及对照组Ad-EGFP分别转染处于对数生长期的人牙周膜成纤维细胞中，72小时后抽RNA，反转录为cDNA，用定量PCR和Westen-blot等方法测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化。
　　 结果：DNA序列测定结果证实重组质粒载体pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C构建正确，插入序列位置正确。PCR及酶切鉴定结果，重组腺病毒含有目的插入序列。定量PCR结果显示转染了CGRP-A，CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞组，CGRP基因含量明显高于对照组。测序显示两实验组细胞内确实含有CGRP-A与CGRP-C基因序列。
　　 结论：成功构建Ad-CGRP-A，Ad-CGRP-C重组腺病毒载体，并成功将CGRP-A，CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞中。
　　 第三部分：检测转染了CGRP-A，CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞的胶原mRNA与胶原蛋白的表达，细胞增殖能力以及细胞成骨分化
　　 目的：研究CGRP-A，CGRP-C基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响。
　　 方法：实验细胞与对照细胞抽提RNA，反转录cDNA后，用定量PCR和Westen-blot测定细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量和胶原蛋白表达；用流式细胞仪测定细胞周期，观察两基因对细胞增殖的影响；钙盐染色定性观察细胞成骨分化。
　　 结果：显示，含有CGRP-A基因的细胞，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量及胶原蛋白的表达明显高于对照组，含有CGRP-C基因的细胞Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量则表达上明显低于对照组；细胞周期测定结果显示，含有CGRP-C基因的细胞增殖能力明显弱于对照组和CGRP-A实验组；钙盐染色可于含有CGRP-A基因的细胞中发现棕黑色条带，但变化不明显。
　　 结论：可以认为多态性的CGRP-C基因抑制胶原蛋白分泌，可能在牙周炎发病当中抑制胶原合成，引起牙周粘附下降，牙齿松动；而多态性的CGRP-C基因可能使细胞增殖受影响，使增殖期牙周膜成纤维细胞减少，影响牙齿与牙槽骨的连接；暂不能说明CGRP基因对细胞成骨分化的影响。