G蛋白偶联受体在催产素缓解吗啡镇痛耐受中的作用

摘要

吗啡作为一种古老的、具有强大镇痛作用的药物,目前仍广泛应用于临床疼痛治疗。然而长期使用吗啡镇痛,将导致部分患者出现耐受、依赖甚至成瘾,从而大大限制了吗啡在临床上的应用。
　　 脊髓背根是伤害性刺激传入的初级中枢,吗啡在脊髓水平的镇痛作用主要通过作用于该区域的中间调节神经元,使其兴奋性降低,抑制痛觉信号上行传递,进而实现镇痛。研究表明,吗啡主要通过μ型阿片受体(MOR)和δ型阿片受体(DOR)发挥其药理学效应。阿片受体属于G蛋白偶联受体超家族成员,与吗啡结合将导致阿片受体构象改变,从而激活下游的G蛋白,解离的Gαi抑制腺苷酸环化酶的活性,导致细胞内cAMP降低;而解离的βγ亚基直接激活膜上的G蛋白偶联的内向整流钾通道,使细胞的兴奋性降低。
　　 有研究显示慢性吗啡所引发的耐受,与吗啡不能有效地诱导阿片受体的内吞和再循环有关。促进阿片受体的内吞和再循环可有效地抑制慢性吗啡处理所诱导的耐受。
　　 G蛋白偶联受体作为最重要的受体分子之一,对于维持机体的内稳态具有重大的意义。统计显示,有近50％的处方药物都是以G蛋白偶联受体作为靶点,其治疗作用和毒副作用不仅与其受体在组织中的分布有关,而且可能与作用的受体与其他受体的相互作用有关。越来越多的研究显示,G蛋白偶联受体(GPCRs)不仅以单体的形式发挥作用,而且还可以二聚体或多聚体形式发挥不同于单体的作用。有报道指出,δ型阿片受体可以与μ型阿片受体可以形成异源二聚体,并且促进吗啡诱导的μ型阿片受体的内吞。
　　 鉴于阿片受体内吞和再循环与否,是吗啡诱导耐受的原因之一,那么有效地促进阿片受体内吞和再循环就可能抑制或对抗吗啡耐受的形成。
　　 我们以往的工作发现,慢性吗啡处理可以抑制大鼠视上核催产素的合成和释放,而特异性促进催产素合成和释放的锂盐可显著抑制慢性吗啡处理所导致的痛觉耐受,同时,这种效应可以被催产素受体的拮抗剂所阻断,提示催产素受体(OTR)可能参与了吗啡镇痛耐受的形成,但其作用机制目前尚不清楚。催产素受体与阿片受体同属于G蛋白偶联受体的A家族成员,但其偶联的G蛋白不同。我们以往的研究发现,催产素受体可以以还原剂敏感的多聚体形式存在,其是否可与阿片受体形成异源二聚体参与阿片受体药理学作用的调节目前尚未见报道。
　　 本研究在我们以往的工作基础上,观察阿片受体和催产素受体异源二聚化对阿片受体内吞的影响,探讨G蛋白偶联受体异源二聚化在吗啡诱导的痛觉耐受中的作用,为开发和设计新的镇痛药物提供理论和实验依据。
　　 以大鼠鞘内给药的方式建立吗啡耐受模型,观察催产素对慢性吗啡处理所诱导耐受形成的影响,结果显示吗啡连续处理至第7天,大鼠形成对吗啡的耐受,而催产素可延缓和抑制耐受的形成。免疫组化显示,大鼠脊髓背角存在着MOR与OTR的共定位;免疫共沉淀显示,脊髓中MOR与OTR存在相互作用。为了进一步确认MOR和OTR的相互作用和生理学意义,我们构建了MOR-OTR共表达转染细胞株,利用免疫共沉淀技术和双分子荧光互补(BiFC)技术,确认了两者间存在的相互作用,同时采用SNAP/CLIP染色标记的细胞影像技术,观察催产素对于吗啡诱导的MOR内吞的影响。结果表明,低剂量的催产素与吗啡联合作用时,可以有效地促进MOR的内吞,而吗啡和催产素单独处理对MOR的内吞没有影响。为了研究MOR和OTR相互作用可能的功能区域,我们表达和纯化了MOR的四个功能区段的GST融合蛋白,利用GST-Pull Down研究介导MOR与OTR相互作用的区段。结果显示,μ型阿片受体第三个胞内环可能参与了其与催产素受体之间的相互作用。
　　 本实验所得结论如下:
　　 1、鞘内注射催产素,可以显著提高吗啡的镇痛效率,延迟耐受的出现。
　　 2、在大鼠脊髓存在着μ型阿片受体与催产素受体的相互作用。并且在脊髓背角,首次观察到了μ型阿片受体与催产素受体的共定位。
　　 3、在体外共表达体系中,μ型阿片受体与催产素受体有相互作用关系;低剂量的催产素可以有效促进吗啡诱导的μ型阿片受体的内吞。
　　 4、μ型阿片受体的第三个胞内环,参与了催产素受体与其的相互作用。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

实验结果

一、动物痛觉耐受实验

二、大鼠脊髓MOR与OTR的免疫组织化学

三、大鼠脊髓MOR与OTR的CO-IP检测

四、体外共表达体系中MOR与OTR的相互作用

(一)稳定转染株的建立与鉴定

(二)受体内吞实验

(三)双分子荧光互补实验(BiFC)

五、GST-Pull Down实验

(一)克隆

(二)GST融合蛋白的诱导表达

(三)GST融合蛋白的分离纯化

(四)GST-Pull Down实验

讨论

一、鞘内注射催产素在吗啡镇痛耐受中的作用

二、催产素对μ型阿片受体内吞的影响

三、催产素受体与阿片受体的异源二聚化研究

四、有待完善的部分

参考文献

结论

文献综述

在读期间参加科研工作情况说明

致谢