基于噬菌体展示的体外分子进化改进NEIBM AL结合特性的研究

摘要

免疫球蛋白结合分子(immunoglobulin(Ig)-binding proteins，IBPs)是由多种病原体产生，并与免疫球蛋白以非抗原形式结合的一类蛋白，在致病中发挥重要作用。其中重要代表分子包括金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SpA)、链球菌(C群和G群)蛋白G(Streptococcal protein G，SpG)以及部分大消化链球菌表面的蛋白L(Peptostreptococcus magnus protein L，PpL)等。研究表明，该类分子均包含由多个序列高度同源的结合结构域头尾相连重复组成的抗体结合区，每个单结构域具有与全分子完全相同的Ig结合特性，形成Ig结合的基本单位。凭借其独特的结合特性，该类分子已在抗体纯化、病原体特异性抗体检测和抗体吸附治疗等方面得到了广泛的应用。
　　 我们利用体外分子进化平台获得了一种由SpAA Ig结合结构域和PpL B3 Ig结合结构域串联而成的非天然存在的新型免疫球蛋白结合分子AL(Novel evolvedIg-binding molecules AL,NEIBM AL，以下简称AL)，该分子能与包括IgM在内的各类人免疫球蛋白Fab段的VH3和κ（轻链形成双结合，其中SpAA与VH3结合，PpLB3与κ链结合。在该双结合模式中，SpAA只与VH3结合，并且其亲和力远低于PpLB3与κ（链的结合。是否可以应用蛋白质工程方法实现SpAA与其他类型的VH结合？或者增强和改进与VH3的结合以进一步加强该双结合以提高其应用潜能？本研究对SpA的A结构域上VH3结合位点周围的氨基酸进行随机突变，构建其噬菌体展示文库，应用IgM为诱导分子对文库进行体外分子进化，以期获得对人IgM结合能力明显改进的突变体，用于提高病原微生物感染的抗体检测效果。
　　 本研究共分以下四个部分:
　　 第一部分NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库的构建
　　 用PCR定点突变技术，依次对NEIBM AL中A结构域上第28、31和35位，第27和34位，第38和39位，第48、49和50位氨基酸进行随机突变，将突变后的片段克隆到噬菌粒载体pCANTAB5S的SacⅠ、KpnⅠ位点中，转化E.coli TG1，并经辅助噬菌体M13K07拯救，获得4个NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库，分别命名为AL-N28-I31-K35随机突变体文库（以下简称为库1），AL-C27-L34随机突变体文库（以下简称为库2），AL-P38-S39随机突变体文库（以下简称为库3）和AL-A48-K49-K50随机突变体文库（以下简称为库4）。所构建的噬菌体展示文库1-4的库容依次为2.6×106、3.0×106、1.8×106和2.0×106(cfu)，滴度依次为2.3×1012、2.0×1012、2.6×1012和2.1×1012(TU/ml)。序列分析显示4个文库的随机突变位点(NNS)中，第一位N的A∶T∶C∶G为14∶9∶11∶8，第二位N的A∶T∶C∶G为5∶11∶10∶16，第三位S的G∶C为24∶18，表明4个文库突变位点上的碱基种类有较好的随机性。上述结果说明所构建的4个NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库能满足用于体外进化筛选的要求。
　　 第二部分人IgM诱导的NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库的体外分子进化
　　 应用人IgM为诱饵分子，通过“吸附”-“洗脱”-“扩增”的重复过程，对上述构建的4个文库分别进行体外诱导筛选，经2-5轮筛选，4个文库中掺入的空噬菌体完全消失，提示库1-4均进化完全。我们在4个筛选后文库中分别随机挑取90个单克隆制备成单克隆噬菌体，应用phage ELISA检测单克隆噬菌体与人IgM的结合活性，结果所有来自库1、库3和库4的单克隆噬菌体与IgM的结合均小于野生型噬菌体，而库2中的少部分单克隆噬菌体显示出高于野生型噬菌体的IgM结合能力。进一步从库2中随机挑取900个单克隆制备成噬菌体，用phage ELISA筛选获得了20个高结合活性的单克隆噬菌体，序列分析证实为7种AL突变分子，分别命名为AL(NS)(C27N,L34S)、 AL(QI)(C27Q,L34I)、 AL(KA)(C27K,L34A)、AL(HE)(C27H,L34E)、AL(HL)(C27H,L34L)、AL(VY)(C27V, L34Y)和AL(VV)(C27V,L34V)。进一步用phage ELISA比较7种AL突变体单克隆噬菌体和野生型AL噬菌体与人IgM和IgG的结合活性，结果7种AL突变体与IgM和IgG结合活性均明显高于野生型噬菌体。同时，我们随机选取了84个中结合活性和60个低结合活性的单克隆噬菌体进行了序列测定，最终得到25种中结合活性的AL突变序列和14种低结合活性的AL突变序列。序列比较发现高结合活性突变体在第27或34位的氨基酸种类与中结合活性突变体、低结合活性突变体并无差异，提示高结合活性的形成并非由第27位或第34位特殊的氨基酸突变形成，而是由第27位和第34位共同突变而形成。
　　 第三部分NEIBM AL突变体的原核表达、纯化及结合特性分析
　　 为了进一步检测7种突变体在蛋白水平上与人IgM和IgG的结合活性，我们将7种突变体AL(VV)、AL(VY)、AL(KA)、AL(HE)、AL(HL)、AL(NS)、AL(QI)以及野生型AL序列分别克隆于原核表达载体pET32a(+)中，构建的重组表达载体pET32a-AL(VV)、 pET32a-AL(VY)、 pET32a-AL(KA)、 pET32a-AL(HE)、pET32a-AL(HL)、pET32a-AL(NS)、pET32a-AL(QI)和pET32a-AL。将构建好的这8种表达载体分别转化表达菌BL21， IPTG诱导表达，超声破菌，离心制备胞液及包涵体，SDS-PAGE分析显示，细菌胞液中出现了分子量大小为35 Kda的表达蛋白，与目的蛋白理论分子量大小一致。进而，大量诱导表达上述蛋白，用Ni-NTA柱亲和层析纯化，获得纯度大于90％的8种蛋白，分别命名为AL(VV)、AL(VY)、AL(KA)、AL（HE）、AL(HL)、AL(NS)、AL(QI)以及AL。用ELISA比较7种AL突变体和AL与人IgM和IgG的结合活性，结果显示仅AL(VV)和AL(KA)两种突变体显示出与AL（野生型）相当的IgM和IgG结合活性，其余突变体与IgM和IgG结合活性均较AL(野生型)弱。
　　 第四部分AL突变体在抗-HCV ELISA检测中的应用
　　 进一步我们将AL(VV)、AL(KA)和AL（野生型）进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，制备HRP-AL(VV)、HRP-AL(KA)以及HRP-AL。用ELISA方法比较HRP-AL(VV)、HRP-AL(KA)和HRP-AL与人IgM和IgG的结合活性，结果显示HRP-AL(VV)、HRP-AL(KA)与人IgM和IgG的结合能力均明显高于HRP-AL。进而，我们用HRP-AL(VV)、HRP-AL(KA)和HRP-AL用作酶标二抗建立抗-HCV ELISA检测方法，比较这3种方法对40份抗-HCV阳性临床血清标本和40份抗-HCV阴性正常献血员血清标本的检出效果，结果这3种方法对40份抗-HCV阴性正常献血员血清标本的检出效果相当，HRP-AL(VV)对40份抗-HCV阳性临床血清标本的检出效果明显好于HRP-AL，显示出统计学差异(P＜0.001)，HRP-AL(KA)的阳性检测反应性也高于HRP-AL，但无统计学差异。
　　 总结:
　　 (1)本研究成功构建4个NEIBMAL定点随机突变体噬菌体展示文库。
　　 (2)应用人IgM为诱饵分子成功地对上述噬菌体文库进行了体外分子进化筛选，获得了7种IgM和IgG结合能力提高的AL突变体分子AL(VV)、AL(VY)、AL(KA)、AL（HE）、AL(HL)、AL(NS)和AL(QI)。
　　 (3)成功地原核表达纯化了7种高结合突变体蛋白AL(VV)、AL(VY)、AL(KA)、AL(HE)、AL(HL)、AL(NS)、AL(QI)和野生型蛋白AL。其中，仅AL(VV)和AL(KA)两种突变体显示出与AL（野生型）相当的结合人IgM和IgG的能力，其余突变体的IgM和IgG结合能力均较AL（野生型）弱。
　　 (4)成功的对AL(VV)、AL(KA)和AL进行HRP标记，HRP-AL(VV)和HRP-AL(KA)与人IgM和IgG结合活性明显高于HRP-AL，更有，HRP-AL(VV)能明显提高抗-HCV ELISA的检测效果，显示出明确的应用前景。
　　 本研究成功进行了对NEIBM AL分子的体外分子进化改造，获得了与人IgM和IgG结合活性明显提高的AL突变体，突变体AL(VV)能明显提高抗-HCVELISA的检测效果，显示出明确的应用前景。本研究同时也提供了一个应用分子进化手段改进蛋白分子功能的成功范例。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库的构建

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 人IgM诱导的NEIBM AL定点随机突变体噬菌体展示文库的体外分子进化

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 NEIBM AL突变体的原核表达、纯化及结合特性分析

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第四部分 AL突变分子在抗-HCV ELISA检测中的应用

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

细菌免疫球蛋白结合分子特性及应用研究进展

附录 个人简历

致谢