靶向胃癌相关成纤维细胞的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体的实验研究

摘要

胃癌目前在中国的发生率及死亡率仍明显高于世界平均水平，手术及化疗效果仍不尽如人意，缺乏特异性是胃癌治疗面临的一个主要问题，因此研发出新的肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。作为肿瘤赖以生存的土壤，肿瘤间质主要由细胞外基质、内皮细胞、免疫细胞以及肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）等组成。CAFs是其中最主要的组成部分，可以分泌肿瘤细胞生长所需的各种细胞因子、生长因子和粘附分子等，促进肿瘤细胞的增殖、分化;分泌多种蛋白酶，促进肿瘤细胞的扩散及转移;CAFs可以明显增强肿瘤细胞逃避机体免疫系统的打击能力，并可以增强肿瘤细胞对放、化疗的抵抗，成为肿瘤难治及复发的根源。此外，有研究表明，CAFs在维持适于肿瘤干细胞生存的微环境过程中也扮演着重要角色。由此可见，CAFs在肿瘤的发生、发展、复发、转移，乃至拮抗放、化疗等过程中都发挥着至关重要的作用。而CAFs具有两个显著特征使其区别于正常的成纤维细胞:首先，绝大多数上皮来源恶性肿瘤的CAFs表面均表达具有丝氨酸蛋白酶活性的成纤维细胞活化蛋白(FAP)，其表达水平与肿瘤的恶性程度存在着明显的正相关，且FAP仅见于活化的成纤维细胞膜表面，正常组织、细胞不表达;其次，高表达具有细胞趋化作用的间质衍生因子CXCL12，该因子及其特异性受体(CXCR4、CXCR7)在肿瘤细胞的增殖、活化、肿瘤新生血管形成以及转移过程中都发挥着非常重要的作用。二者是肿瘤间质治疗的研究热点。由此，靶向CAFs进行肿瘤间质治疗，使肿瘤成为无本之木，是一种非常有前景的肿瘤治疗策略。但以往的研究多以小分子药物或单克隆抗体为主，不仅制备工艺复杂，且靶点相对单一，疗效有限。鉴于此，我们在本研究中引入了肿瘤间质生物治疗的概念，即利用溶瘤腺病毒特异性地杀伤CAFs。
　　 重组腺病毒是一种非常优良的载体，具有致病性低、不与宿主基因组整合（低致癌性）、可感染处于静止和非静止期的细胞、允许装载较大的外源DNA片段、基因表达谱及相应的蛋白功能的了解比较清楚以及易于大规模制备和纯化等诸多优点，被广泛应用于基因治疗的各个领域。但其在临床应用中仍存在一定限制，主要有:1、目前常用的腺病毒载体（C亚群的Ad2、Ad5）宿主范围广泛，对几乎所有的哺乳类动物细胞都有一定的感染能力，但靶向性欠佳;2、受细胞表面受体和整合素表达水平的限制，腺病毒对不同细胞组织的感染能力差别很大，对CAFs的感染效率较低;3、Ad2、Ad5虽有易于大规模制备的优点，但经系统途径给药时易在肝脏富集，导致其不仅难于到达肿瘤发生部位，还可能造成严重的肝毒性;4、CAFs的存在会明显减弱腺病毒的治疗效果;5、成人体内大多存在有针对Ad2、Ad5的中和抗体，系统途径给予腺病毒时易激发机体的免疫反应从而被清除。为此，我们拟在保留腺病毒固有优点的基础上，综合运用纤毛蛋白修饰、转录水平调控以及六联体嵌合等多种策略对腺病毒载体进行改造，构建一种可以特异、高效地感染并杀伤CAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，本文通过体外实验对构建4种靶向FAP增殖型溶瘤腺病毒对胃癌相关成纤维细胞的选择性杀伤能力进行评估，并进一步观察不同给药途径对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果。希望通过本研究为肿瘤间质治疗开辟一条新的途径，对于降低胃癌的复发率、减少死亡率、提高患者的生存质量以及减轻患者家庭的经济负担都具有重要的现实意义。
　　 方法和结果:
　　 1、纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体构建、重组及制备
　　 利用pShE1、pENTR-GF-LA、pAd Rc/delLA三载体系统对腺病毒基因组进行重组，以SG600系统的穿梭载体(pSG502，由本课题组构建)为模板，通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，用CXCL12基因启动子（已克隆、测序并验证功能）替换原穿梭载体的腺病毒E1A基因启动子(即端粒酶逆转录酶启动子，hTERTp)，同时保留E1B基因启动子（5×HRE及CMV），构建新的穿梭载体pShSDF-E1。利用In-Fusion位点特异性重组技术，在pENTR-GF-LA的SpeI位点处插入合成的FAP特异性识别肽段对应的碱基序列，得到pENTR/FAP;利用pAdRc/delLA中特异的酶切位点(AscI、XmaI等)，通过PCR、酶切、连接等分子生物学方法，以嵌合型六联体基因(H5HVR48，全基因合成)替换Ad5原有的六联体基因，得到含有Ad48高变区的嵌合型六联体的腺病毒骨架质粒载体pAd5HVR48-Rc/delLA。利用高效的位点特异性重组(Gateway)技术，介导pENTR/FAP与pAd5HVR48-Rc/delLA之间的重组，利用ccdB的毒性作用和氨苄青霉素抗性筛选重组子，将改造好的腺病毒基因组的右端序列还纳到骨架质粒载体内，得到经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒骨架质粒pAd5HVR48/FAP/delE1E3;将pShSDFpE1与pAd5HVR48/FAP/delE1E3共转染大肠杆菌E.coli B J5183，进行细菌内同源重组，利用卡纳霉素抗性筛选重组子，得到E1A和E1B基因分别受CXCL12启动子和缺氧反应元件(HRE)调控、经纤毛蛋白修饰的六联体嵌合型重组腺病毒质粒pAd5 HVR48/SDFp/FAP;验证正确的重组子，经限制性内切酶PacI充分消化，暴露腺病毒基因组两端的反向末端重复序列(ITR)，用脂质体包裹后，转染腺病毒包装细胞株HEK293A，包装形成病毒颗粒，经三次空斑纯化，得到靶向感染癌相关成纤维细胞并复制增殖的六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，同时构建了相应的复制缺陷型（E1区缺失）腺病毒载体以及对照载体pRCAdHVR48-SDF1p-RGD-4C/EGFP(HI环内插入RGD-4C短肽序列)。对其进行大量扩增、CsCl密度梯度离心纯化后，TCID50法检测病毒滴度，-80℃冻存，备用。
　　 2、溶瘤腺病毒载体对CAFs感染、杀伤以及增殖能力检测
　　 GCAFs分离培养:取长海医院普外一科2012年4月-8月临床胃癌患者术后组织标本及癌旁组织（5例），利用胶原酶消化发分离、10％FBS-DMEM/F12培养基培养GCAFs及胃癌旁粘膜成纤维细胞(GPFs)。利用流式细胞技术(FACS)检测其FAP、CXCL12和整合素（αvβ3、αvβ5等）表达情况。
　　 病毒感染能力测定:取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=100加入4种复制缺陷型腺病毒，4℃孵育1h，冷PBS洗去未结合的病毒，换用5％FBS-DMEM/F12培养基。37℃5％CO2条件下孵育48h后，荧光显微镜下观察拍照，FACS检测EGFP表达情况。QIAamp试剂盒提取病毒基因组DNA，利用绝对定量PCR（SYBR Green法）检测腺病毒(E4区基因)拷贝数。以GAPDH作为内参照，以正常成纤维细胞株BJ作为阴性对照。Westenblot检测复制缺陷型腺病毒感染GCAFs后细胞裂解液中Hexon蛋白表达情况。在给予FAP抗体阻断后PCR检测及Westenblot检测均显示腺病毒结合水平明显下降。
　　 病毒增殖实验:取对数生长期细胞，铺6孔板（1×105/孔），37℃，5％CO2孵育24hr;换用无血清培养液，按MOI=5分别加入病毒;2hr后换含5％血清培养液;分别收集病毒感染0hr、6hr、12hr、24hr、48hr和96hr的细胞及上清液;按标准的50％组织培养感染剂量(TCID50)法检测病毒滴度，与0hr的病毒滴度比较，得到病毒在感染细胞后不同时间的增殖倍数。
　　 荧光显微镜镜检观察病毒增殖情况:将携带绿色荧光EGFP报告基因的4种腺病毒以MOI=0.1分别转染正常细胞BJ、胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞，转染后第1、3、7、10天在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在正常BJ细胞中绿色荧光持续单个、分散存在;而在胃癌细胞和胃癌相关成纤维细胞中随着时间延长，绿色荧光的表达由散在、单个存在逐渐变为集中、融合存在，并出现CPE现象。同时，可发现4种重组腺病毒在胃癌细胞及胃癌相关成纤维细胞中均存在复制、增殖，溶解细胞的过程。
　　 细胞杀伤能力检测:取对数生长期的GCAFs细胞，接种六孔板，1×105/孔，分别按MOI=1加入4种增殖型溶瘤腺病毒，分别于感染后3、7、10Days荧光显微镜下观察拍照。WST1检测溶瘤腺病毒对GCAFs的杀伤能力。
　　 3.增殖腺病毒治疗裸鼠移植瘤的疗效观察
　　 瘤内注射增殖型腺病毒治疗裸鼠原代胃癌移植瘤:
　　 取对数生长期的人原代胃癌细胞，胰酶消化后，PBS重悬、计数，并稀释成1×108/ml细胞悬液，接种于裸鼠皮下（100μl/只）。成瘤后，无菌条件下切取肿瘤组织，切成1mm3大小组织块，重新种植于裸鼠皮下，构建移植瘤裸鼠模型。待肿瘤生长至0.5cm3大小时，将其随机分为以下治疗组:
　　 在BALB/C小鼠右侧肋腹部皮下建立原代胃癌移植瘤模型，随机将成瘤裸鼠分为五组:RCAd5HVR48/SDFp/FAP-Ad/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-P9-4C/EGFP、RCAd5HVR48/SDFp/FAP-GP/EGFP、同时设阴性对照组（注射PBS），n=5。除特别指出，所有溶瘤腺病毒治疗组的病毒剂量均为1×108pfu/100μl，采用单盲对照方法进行试验，溶瘤腺病毒载体及PBS均经系统途径给予，结果统计分析采用非配对t检验。
　　 实验结果表明四个治疗组同阴性对照组相比，能明显的抑制肿瘤生长，具有显著差异(P＜0.01)。在四个治疗组中，GP、P9-4C、P9、Ad在整个治疗过程中对肿瘤杀伤效果程递减趋势(P＜0.05)。常规病理切片检查发现治疗组同对照组相比，肿瘤组织中有大量坏死灶出现，免疫组化检查检测到病毒治疗组的瘤体组织内腺病毒Hexon蛋白表达，说明增殖腺病毒能在肿瘤细胞内增殖，明显抑制移植瘤的生长。
　　 结论:
　　 本文成功构建了纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体:pRCAdHVR48-SDF1p-Ad/EGFP、 pRCAdHVR48-SDF1p-P9/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-P9-4C/EGFP、pRCAdHVR48-SDF1p-GP/EGFP，其可特异、高效地感染并杀伤GCAFs，且低肝脏亲嗜性、低免疫原性的溶瘤腺病毒载体，体外实验表明4种重组腺病毒可以选择性地在FAP阳性GCAFs及胃癌细胞中增殖、杀伤，而在正常细胞中基本不增殖，且4种腺病毒在感染能力和杀伤作用上由Ad、P9、P9-4C、GP逐渐增强，在FAP抗体阻断GCAFs表面FAP后，4种腺病毒结合GCAFs能力明显下降。用重组腺病毒治疗裸鼠胃癌移植瘤模型观察到明显的抗肿瘤作用。以上实验结果表明靶向FAP的重组腺病毒可靶向杀伤胃癌相关成纤维细胞及胃癌细胞，是一种有效且安全的溶瘤病毒，为胃癌的生物靶向治疗提供了一种新的策略，可取得更明显抗肿瘤疗效。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

【第一部分】 纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒载体构建、重组及制备

材料和方法

附录1：腺病毒质粒载体RCAd5HVR48/SDFp/FAP/EGFP构建流程图

附图2：T-SDF1-P测序报告

结果

讨论

参考文献

【第二部分】 靶向胃癌相关成纤维的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒的体外研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

【第三部分】 靶向胃癌相关成纤维的纤毛蛋白修饰、六联体嵌合型溶瘤腺病毒的体内研究

材料和方法

结果

讨论

参考文献

总结

综述

致谢